Формирование вывода и заключения специалиста и эксперта по днк анализу

- объекты от трупов (фрагменты, отчлененные части тела, мягкие 
ткани и пр.).

Моча и пот не исследуются, т. к. в норме не содержат клеток с ядрами, а следовательно, и ДНК.

Непосредственным объектом экспертного исследования является ДНК, выделенная из клеток организма человека (кровь, сперма, кости, хрящевая и мышечная ткань, волосяные луковицы и др.).

Иными объектами судебно-экспертного молекулярно-генетического исследования могут быть:

- сравнительные образцы  крови, изъятые у заведомо известных  лиц;

- материалы уголовного  дела, относящиеся к предмету  экспертизы;

- протоколы осмотра места  происшествия, протоколы изъятия  вещественных доказательств и контрольных образцов;

- заключения судебно-медицинского  исследования трупа, освидетельствования  живого лица;

-заключение судебно-биологической  экспертизы.

Методы исследования. Для проведения экспертного исследования применяются молекулярно-генетические методы, такие как метод выделения и очистки ДНК, количественной и качественной оценки выделенной ДНК, синтеза и размножения специальных участков ДНК, установления структуры ДНК, типирования ДНК, программно-статистической обработки и другие известные методы.

Задачами данного вида экспертного исследования являются: определение генотипа человека (идентификация личности), установление кровного родства (материнства, отцовства и замены детей), установление возможности происхождения пятен биологических жидкостей от проходящих по делу лиц.

Классифицируя по уровням решения экспертных задач их можно разделить на:

1. Идентификационные:

А) установление личности по биологическому следу:

- путем сравнения с  биологическим образцом подозреваемого  лица;

- путем сравнения с биологическими образцами близких родственников;

Б) установление факта принадлежности биологических объектов одному человеку;

2. Диагностические:

А) установление наличия ДНК и ее пригодности к исследованию;

Б) установление факта биологического родства;

- по материнской линии;

- по отцовской линии;

3. Классификационные:

А) установление пола лица по биологическому следу;

Б) установление этноса по биологическому следу.

Основные методы исследования ДНК: 
гибридизация и электрофорез.

Способность к гибридизации двух препаратов ДНК служит строгим тестом на комплементарность их последовательностей. Существуют два основных способа проведения реакции – это гибридизация в растворе и гибридизация на фильтре.

В случае гибридизации в растворе препараты одноцепочечной ДНК смешивают и отжигают непосредственно в растворе. Данный способ имеет существенный недостаток: цепи препаратов ДНК могут одновременно ренатурировать с образованием как гибридных, так и исходных двухцепочечных молекул ДНК. Поскольку обе реакции конкурируют между собой, то трудно оценить степень гибридизации.

Этот недостаток легко преодолеть, если один из препаратов ДНК иммобилизовать так, чтобы он не мог ренатурировать. Для этой цели используют нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтры (мембраны), на поверхности которых адсорбируют одноцепочечную ДНК. Затем фильтр с иммобилизованной ДНК инкубируют в растворе второго препарата ДНК, который обычно содержит метку (радиоактивную, флуоресцентную и т.п.). Гибридизация иммобилизованной ДНК и ДНК-зондов (т.е. ДНК, содержащей метку) происходит только в том случае, если их последовательности комплементарны.

Анализ результатов гибридизации проводят по метке, оставшейся на фильтре. Этот способ гибридизации используется во многих методах криминалистического ДНК-анализа.

Фрагменты ДНК различной длины могут быть фракционированы методом электрофореза. Этот метод является важнейшим методом исследования ДНК и широко используется в криминалистическом ДНК-анализе. Средой для электрофореза служат агарозные или полиакриламидные гели, формирующие сетчатую структуру с величиной ячеек, соизмеримой с величиной молекулы ДНК. Перед электрофорезом пробы ДНК вносят в специальные лунки геля, которым будут соответствовать его дорожки. После наложения электрического поля фрагменты ДНК (имеющие отрицательный заряд) начинают перемещаться к аноду (положительно заряженному электроду), испытывая сопротивление сетчатой среды геля. Чем короче фрагмент, тем меньшее сопротивление он испытывает и тем быстрее он движется (скорость миграции обратно пропорциональна логарифму длины фрагмента). В результате электрофореза в геле образуются полосы (рис. 5). Те полосы, которые располагаются ближе к аноду, соответствуют меньшим по длине фрагментам, а те, которые дальше, – большим. Для определения длины фрагментов ДНК на гель наносят специальный маркер, т.е. пробу, содержащую смесь фрагментов известной длины. Ориентируясь на расположение полос маркера и полосы фрагмента ДНК неизвестного размера, устанавливают его длину (см. приложение).

Синтез ДНК: полимеразная цепная реакция.

Наличие у ДНК таких свойств, как возможность разделения полинуклеотидных цепей и принцип комплементарного соединения азотистых оснований, предполагает, что каждая отдельная цепь ДНК может служить матрицей для построения второй комплементарной цепи, т.е. информация, необходимая для воспроизведения последовательности оснований в ДНК, заложена в структуре ее двойной спирали. Такой механизм синтеза ДНК, когда в результате образуются две молекулы, в которых одна цепь состоит из исходной родительской цепи, а вторая синтезирована на ее основе, называют полуконсервативным.

Полуконсервативный синтез представляет собой сложный ферментативный процесс. Основным ферментом, ответственным за синтез новой цепи, является ДНК-полимераза. Данный фермент обладает свойством удлинять цепь ДНК, последовательно присоединяя по одному нуклеотиду к 3'-концу (рис. 6), осуществляя синтез в направлении 5'–3'. ДНК-полимераза самостоятельно не может инициировать синтез на одноцепочечной ДНК; для этого необходим небольшой участок двухцепочечной ДНК. Чтобы его создать и инициировать синтез, к матричной ДНК добавляют короткий фрагмент одноцепочечной ДНК (около 20 п.н.), называемый ДНК-затравкой или праймером. Нуклеотидная последовательность ДНК-затравки должна быть комплементарна определенному участку матричной ДНК. Предшественниками синтеза ДНК и источником энергии для реакции являются нуклеозидтрифосфаты (dNTP), которые в процессе этой реакции утрачивают две конечные фосфатные группы. Выбор нуклеотида, добавляемого к цепи, определяется комплементарностью оснований.

На основе полуконсервативного синтеза ДНК в 1985 г. Мюллисом был открыт универсальный метод синтеза заданной последовательности ДНК, названный методом полимеразной цепной реакции (ПЦР – Polymerase chain reaction, PCR) [4, 5]. ПЦР представляет собой циклический процесс, осуществляемый при участии ДНК-полимеразы и обеспечивающий амплификацию (копирование) имеющейся последовательности ДНК. В процессе реакции данная последовательность накапливается экспоненциально, и к концу реакции ее количество измеряется миллионами копий. Границы амплифицируемого участка ДНК определяются двумя праймерами, комплементарными 3'-концам интересующей последовательности.

Рис. 3. Схема синтеза ДНК на матричной цепи. Фермент ДНК-полимераза добавляет нуклеотиды к 3'-концу растущей цепи

 

Цикл амплификации состоит из трех фаз: денатурации, отжига и достраивания, различающихся температурой. В первой фазе под действием высокой температуры (около 94–95 °С) происходит денатурация ДНК с образованием одноцепочечных молекул. Во второй фазе температура снижается и происходит отжиг праймеров на комплементарных им участках матричной ДНК. Температура, которая требуется для отжига праймеров, зависит от состава оснований праймеров и обычно составляет 50–70 °С. При более низкой температуре может происходить ренатурация исходной матричной ДНК и появление неспецифических продуктов реакции. В период третьей фазы с участием ДНК-полимеразы происходит синтез или достраивание цепи, комплементарной матричной. Температура обычно варьирует в диапазоне 70–75 °С. В результате к концу цикла количество ДНК с заданной последовательностью удваивается.

В следующих циклах температурные фазы повторяются, при этом в качестве матричной ДНК служат не только исходные молекулы ДНК, но и те цепи, которые были синтезированы в предыдущих циклах. Теоретически, к концу 30-го цикла амплификации на основе одной молекулы ДНК синтезируется 109 копий интересующей последовательности.

На первоначальных этапах применения метода ПЦР в качестве полимеразы использовали фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. Coli. Поскольку этот фермент инактивировался при температуре денатурации ДНК, его необходимо было добавлять в каждом цикле на этапе достраивания цепи. Этот недостаток был преодолен после выделения из бактерии Termus aquaticus, обитающей в горячих источниках при температуре 70–75 °С, термостабильной полимеразы (Taq-полимеразы). Использование этой полимеразы при ПЦР позволило автоматизировать процесс амплификации, что способствовало его широкому внедрению при исследованиях ДНК.

Использование метода генотипоскопии позволяет разрешить многие проблемы, возникающие при раскрытии и расследовании преступлений. По данным лаборатории генотипоскопических исследований сегодня с его помощью возможно:

1. Устанавливать происхождение крови, спермы, слюны, волос, тканей, органов и некоторых других объектов от конкретного лица.
2. Устанавливать происхождение крови, спермы, слюны, волос, тканей, органов, отчлененных частей тела и др. от одного лица.
3. Объединять преступления, если их совершило одно и то же лицо и оставило следы биологического происхождения, например сперму.
4. Определять, не наступила ли беременность от лица, подозреваемого в совершении изнасилования.
5. Устанавливать конкретных участников событий в случаях обнаружения смешанных следов биологического происхождения. (То есть эксперт при необходимости может сказать, что данное конкретное пятно крови образовано кровью нескольких лиц, и указать, каких конкретно.).
6. Определять, относятся ли части трупа, обнаруженные отчлененными, к одному или разным телам.
7. Устанавливать, могут ли конкретные мужчина и женщина быть родителями ребенка.
8. Идентифицировать неопознанные трупы.
9. Устанавливать наличие близкого и дальнего родства по материнской и отцовской линии.

Возможно решение и других, сходных с указанными, задач, возникающих при раскрытии и расследовании преступлений.

Немаловажное значение имеет формулирование вопросов на генотипоскопическое исследование. К вопросам, которые ставятся на разрешение перед экспертными исследованиями, предъявляются требования, выработанные экспертной и следственной практикой, основными из которых являются:

• вопросы не должны выходить за пределы специальных знаний эксперта;
• вопросы не должны носить правовой характер, т.к. такого рода вопросы разрешаются следователем и судом;
• вопросы должны быть лаконичными, краткими и четкими, а если перед экспертизой поставлено несколько вопросов, то между ними должна быть четкая логическая связь и последовательность;
• не рекомендуется объединять несколько вопросов, на каждый из которых может быть дан самостоятельный ответ.

Примерные вопросы, ставящиеся на разрешение перед генотипоскопическими экспертными исследованиями:

-  Возможно ли извлечение генетического материала (ДНК) из крови, обнаруженной на одежде гр. Ф?

- Пригодна ли ДНК из крови, обнаруженной на одежде гр. Ф для экспертного исследования?

- Возможно ли установить  генотип крови, обнаруженной на  одежде гр. Ф?

- Лицу какого пола принадлежала  кровь, обнаруженная на одежде гр. Ф?

- Кровь, обнаруженная на  одежде гр. Ф, принадлежит гр. Ф, гр. Р или другому лицу?

Особенности отбора, изъятия, упаковки и хранения вещественных доказательств.

Вещественные доказательства со следами биологического происхождения (кровь, сперма) изымаются на месте происшествия, упаковываются и транспортируются в соответствии с требованиями, предъявляемыми к вещественным доказательствам, направляемым на судебно-медицинское исследование. Однако ввиду того, что ДНК сильно подвержена разрушающему действию ферментов, чувствительна к факторам окружающей среды (температура, влажность), наличию бактерий и загрязнениям чужеродной ДНК, к обращению с вещественными доказательствами, по которым, возможно, будет назначаться молекулярно-генетическое исследование, должно быть уделено повышенное внимание. В связи с чем следует учитывать следующие особенности отбора, изъятия, упаковки и хранения вещественных доказательств.

- предметы до следами  крови надо брать руками за  участки, свободные от крови, иначе  можно нанести загрязнение;

- вещественное доказательство  со следами биологического материала  изымаются вместе с предметом-носителем  и направляют на экспертизу  целиком: при расположении пятен  на громоздких предметах-носителях  изымается часть предмета со  следами биологического материала;