Ретикулоцитарные и эритроцитарные показатели периферической крови в системе оценки у лиц, занимающихся и не занимающихся спортом

Существует ряд математических алгоритмов, в основе котоых лежат результаты межгруппового дискриминационного анализа. Так, Ю.В. Кузнецова и др. (2000) для дифференциации абсолютного и перераспределительного дефицита железа, а также малой формы талассемии в качестве скринингового теста предлагают применять рассчитанные дискриминационные формулы с применением только эритроцитарных показателей гемограммы, где вероятность достоверности предсказания более 90%. Другие специалисты для дифференировки мегалобластных анемий рассчитали дискриминационные формулы на основе ретикулоцитарных и эритроцитарных показателей, а также уровня сывороточного билирубина с вероятностью достоверности предсказания более 58% (C.W. Chan et al., 2007). Однако, по мнению ряда специалистов (M. Sirdah et al., 2008; M. Ferrara et al., 2010), использование дискриминационных формул в системе дифференцированной оценки эритропоэза имеет весьма ограниченную диагностическую ценность.

Задача описания функционирования эритропоэза, и в частности кинетики его периферического звена в различных условиях, в целом далека от своего решения вследствие большого многообразия и сложности протекающих в нем взаимосвязанных процессов. В рамках данной проблемы анализ медико-биологических данных, получаемых посредством гемограмм, разработка математических моделей и численных алгоритмов оценки функционального состояния системы красной крови представляют собой активно развивающееся направление применения методов математического моделирования и информационных технологий в исследованиях физиологии эритропоэза.

 

1.6. Заключение

Функциональное состояние  эритропоэза зависит от обеспеченности организма пластическими резервами, в первую очередь, железом. При этом определение сывороточного ферритина является общепризнанным “золотым стандартом”, дающим представление о запасах микроэлемента в организме (Ю.В. Кузнецова и др., 2000; В.В. Долгов и др., 2002; J.D. Cook, 2005; С.А. Луговская и др., 2006; J.A. Moreno Chulilla, 2009). Не менее ценную информацию о функциональном состоянии эритропоэза, без удорожания стоимости обследования, предоставляют ретикулоцитарные и эритроцитарные показатели периферической крови, диагностическая ценность которых может быть повышена при их комплексном использовании с применением методов структуризации информации.

Общеизвестно, что при  интенсивных физических нагрузках  значения показателей морфологического состава крови существенно изменяются, отражая, с одной стороны, функциональное состояние эритропоэза, с другой же, уровень тренированности, протекание адаптационных процессов и др. В данных аспектах информация, получаемая посредством анализа ретикулоцитарных и эритроцитарных показателей периферической крови, имеет несомненную практическую ценность в плане оптимизации медико-биологического контроля спортивной деятельности. При этом вопросы, касающиеся как патогенетических механизмов изменений в системе эритропоэза под влиянием спортивной деятельности, так и гематологических маркеров, отражающих перенапряжение системы крови, остаются открытыми.

 

Глава 2. МЕТОДЫ И ОРГАНИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

 

2.1. Методы анализа  ретикулоцитарных и эритроцитарных  показателей

Анализ ретикулоцитарных и эритроцитарных показателей проводился при помощи гематологического анализатора Sysmex XЕ–2100 (Япония) на базе Краснодарского диагностического центра городской больницы № 2.

Определение ретикулоцитарных показателей. Для определения ретикулоцитарных параметров был использован ретикулоцитарный блок анализатора, основанный на технологии проточной цитофлюорометрии с применением флуоресцентного красителя полиметина. Анализ проводился в проточной кювете при пересечении луча лазера длиной 633 нм.

Посредством ретикулоцитарного блока  анализатора определяли:

– относительное количество ретикулоцитов – Ret%, (%);

– абсолютное количество ретикулоцитов  – Ret# (x10¹²/л);

– количество ретикулоцитов с низкой флуоресценцией – LFR%, % (Low Fluorescence Ratio);

– количество ретикулоцитов со средней  флуоресценцией – MFR%, % (Middle Fluorescence Ratio);

– количество ретикулоцитов с высокой флуоресценцией – HFR%, % (High Fluorescence Ratio);

– количество незрелых ретикулоцитов  – IRF, % (Immature Reticulocyte Fraction, IRF= MFR+HFR);

– содержание гемоглобина в ретикулоцитах  – Ret–He, пг (расчетный показатель, определяемый согласно известной формуле L. Thomas и Ch. Thomas (2002): , где x – значение канала прямого светорассеяния лазерного луча).

Определение эритроцитарных показателей. Определение числа эритроцитов (RBC, red blood cells) в единице объема крови (л) основано на принципе гидродинамического фокусирования и апертурноимпенсадантном методе. Нормальными считали значения показателя 4,2 – 5,6 10¹²/л у мужчин и 3,5– 5,5 10¹²/л у женщин.

Определение концентрации гемоглобина (HGB, hemoglobin) осуществляли спектрофотометрически на основании гемиглобинцианидного метода. Нормальными считали значения показателя 13,0–17,2 г/дл у мужчин и 12,0-15,2 г/дл у женщин.

Величину гематокрита (HCT, hematocrit) определялиь автоматически, исходя из процентного соотношения суммы прямо измеренных объемов эритроцитов к единице объема крови. Нормальными считали значения показателя у мужчин 38–44 % и 32–44,5 % у женщин.

Определение среднего объема эритроцита (MCV, mean corpuscular volume) производили на основании прямой зависимости амплитуды электрического импульса от объема клетки, что выражали в фемтолитрах (1фл = 1 мкм³). Нормальными считали значения показателя 79-98 фл.

Значение среднего содержания гемоглобина  в эритроците (MCH, mean corpuscular hemoglobin) рассчитывали автоматически путем деления концентрации гемоглобина (г/дл) на количество эритроцитов (млн/мкл) и выражали в пикограммах. Нормальными считали значения показателя 27-35 пг.

Величину средней концентрации гемоглобина в эритроците (MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration) вычисляли автоматически по формуле: HGB (г/дл) х 100/ HCT (%). Нормальными считали значения показателя 30–38/дл.

Значение показателя распределения количества эритроцитов  по объему (RDW, red cell distribution width) рассчитывали автоматически как коэффициент вариации объема эритроцитов по формуле:

.                                                    (1)

Нормальными считали  значения показателя 11,5-14,5%.

При интерпретации результатов  гематологических тестов у лиц молодого возраста, не связанных с напряженной мышечной деятельностью, ориентировались на референтные значения показателей, представленные в литературных источниках (А.Н. Окороков, 2001; С.А. Луговская и др., 2006; А.А. Кишкун, 2007), а также на данные фирмы производителя.

Анализ гематологических параметров у высококвалифицированных спортсменов, специализирующихся в видах спорта, направленных на преимущественное развитие выносливости, осуществляли на основании сведений, представленных Г.А. Макаровой и С.А. Локтевым (1990).

Определение эффективного эритропоэза

Для определения величины эффективного эритропоэза производили  деление количества ретикулоцитов  в 1 мкл крови на время созревания ретикулоцитов в сутках (Е.Н. Мосягина, 1976, цит. по Г.И. Козинец и Е.Д. Гольдберг, 1982). При этом измерение длительности созревания ретикулоцитов определяли на основании уровня гематокрита по диагностической шкале, предложенной С.А. Луговской и др. (2006).

 

2.2. Методы анализа  избранных биохимических параметров

Определение биохимических  показателей производили на анализаторе Cobas Integra (Швейцария).

Для определения концентрации сывороточного  железа (СЖ) использовали гуанидин-феррозиновый тест; латентную железосвязывающую способность сыворотки (ЛССЖ) оценивали в прямой реакции с феррозином; концентрацию сывороточного ферритина (СФ) определяли иммунотурбодиметрическим методом, а общего белка сыворотки (ОБ) –путем учета результатов биуретовой реакции. Нормальными считали следующие диапазоны значений показателей:

- сывороточного железа – 9-29 мкмоль/л (мужчины), 7-27 мкмоль/л (женщины);

- латентной железосвязывающей  способности сыворотки крови – 20-67 мкмоль/л;

- сывороточного ферритина – 30-250 нг/мл (мужчины), 30-150 нг/мл (женщины);

- общего белка – 65-85 г/л.

 

2.3. Математический  аппарат анализа

Полученные  данные были подвергнуты математическому анализу, включающему традиционные статистические и дополнительно разработанные нами методы.

Методами математической статистики с применением пакетов  программ «Statistika-6.0», «Microsoft Office Excel 2003», «SPSS–10.0» (Г.Ф. Лакин, 1990; В.В. Власов, 2001) определяли: среднюю арифметическую величину (X), ошибкусредней арифметической величины (Er_x), среднее квадратичное отклонение (Sd), медиану (med), минимальное (min) и максимальное (max) значение показателя. Для характеристики свойств распределения параметров использовали показатель асимметрии (As) со стандартной ошибкой асимметрии (Er_as) и показатель эксцесса (Ex) со стандартной ошибкой эксцесса (Er_ex). Выборки анализируемых показателей проверяли на принадлежность к генеральной совокупности с нормальным распределением на основе оценки коэффициентов асимметрии и эксцесса, а также с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между сравниваемыми показателями (р) устанавливали в зависимости от свойств распределения при помощи t–критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили по Спирмену с расчетом достоверности коэффициентов корреляции (r). При этом анализировали статистически значимые коэффициенты корреляции (при р<0,05).

Для определения информативной  ценности анализируемых показателей  в плане разграничения двух выборок, а также для установления наиболее корректной точки разделения, использовали ROC-анализ (построение характеристических графиков). Площадь под графиком (ROC_AREA) являлась интегральным критерием, оценивающим прогностические свойства диагностической шкалы. Приближение значения ROC_AREA к 1,0 соответствовало более значимым классификационным свойствам шкалы. Для подтверждения информативности ROC–кривой применяли показатель стандартной ошибки диагностической шкалы (SE_AREA). Если на основании ROC-анализа показатель оценивался как диагностически ценный, определяли оптимальное пороговое значение диагностической шкалы (cut–off–point), которое делило её на две части, соответствующие альтернативным прогнозам. Кроме того, результатом анализа являлось установление чувствительности (Se) и специфичности (Sp) ретикулоцитарного или эритроцитарного параметра в отношении альтернативных прогнозов (В.П. Булыгин, А.Г. Чепайкин, 2003). 

С целью разделения двух выборок использовали дискриминантный анализ, предполагающий построение линейных комбинаций параметров (функций), в которые каждый из анализируемых показателей входит со своим коэффициентом (вкладом). Для каждого комплекса параметров определялась вероятность достоверности предсказания принадлежности к одной из двух групп (P_d), на основе которых рассчитывали итоговое корректное соотношение.

Результатом данного  метода являлось построение систем классификационных уравнений, имеющих вид:

DF = b₁x₁+…b_ixi+…+b_px_p+C,                                             (2)

где DF – значение дискриминантной функции; b_i - вклад i-го показателя в значение функции; x_i – численное значение i-го показателя в значении функции; p – число показателей; C – константа.

 Решение задачи классификации, то есть соотнесение результатов гемограммы с отдельным функциональным состоянием эритропоэза, производили путем подстановки численных значений параметров в разработанные уравнения и определения максимума одной из дискриминантных функций.

Дополнительно, совместно с доцентом кафедры общей физики и информационных систем Кубанского государственного университета Онищуком Сергеем Алексеевичем, были разработаны новые методы математического моделирования, включающие S-функцию и алгоритм вероятностного анализа.

Расчет S-функции, описывающей изменение каждого показателя гемограммы при устранении дефицита железа, осуществляли на основе экспериментальных данных с учетом основополагающих теоретических постулатов, касающихся динамических характеристик систем (теорема Пригожина, принцип Ле Шателье). В дальнейшем, путем дифференцирования S-функции, были вычислены функции скорости и ускорения изменений анализируемых показателей.

Обоснование вероятностного алгоритма анализа функционального состояния эритропоэза базировалось на основополагающих постулатах теории вероятностей, включающих теорему Якоба Бернулли. При этом с целью построения вероятностных графиков суммировали плотности вероятности значений показателей (для всех функциональных состояний) и нормировали их до 100%, получая, таким образом, асимметричные вероятностные распределения. Распределения с левосторонней асимметрией описывали четырехпараметрической функцией (3), ранее применявшейся для аппроксимации небиологических вариационных рядов (С.А. Онищук, 1989). При этом параметр Н вычисляли по уравнению (4):

 

                                        (3)

 ,                                                       (4)

где Н - значение плотности  вероятности в моде, В - величина моды, С – разница между краем  распределения и модой, m и n - параметры  функции распределения, определяющие асимметрию и эксцесс, Г - гамма-функция. Для описания распределений с правосторонней асимметрией использовали симметричную функцию.

Итоговый вероятностный  анализ функциональных состояний эритропоэза осуществляли на основе рассчитанного алгоритма (И.Б. Барановская, С.А. Онищук, 2008).