Иммунобиологик ва микробиологик препаратлар технологияси мутахассислиги

Молекуляр лигандларнинг  хужайра ичига кириши ва уларнинг специфик рецепторлар билан узаро  таъсири механизмининг универсал  гепотезаси [25] қуйидаги ходисаларни тахмин қилади: лигандлар молекуласи мембрана юзасида эркин кўчиб юрувчи рецепторлар билан ўзаро таъсирлашади; якка лиганд-рецепторли комплексларнинг муайян мембрана оқсиллари хисобига гурухларга бирикиши руй беради бунда улар мембрана текислигида катта микдорда цитоплазманинг кискарувчи-фибриллар элементлари билан боғланиши туфайли кўчиб юриш қобилиятини йўқотади. Мембрана юзасига фиксирланган лиганд-рецептор комплекслари эндоцитозга учрайди. Инсулин интернализацияси харакатчан рецептор модели билан тушунтирилади [26,27,28,29]. К.К. Gambhir ва хаммуаллифларнинг аниклашларича (1980) соғлом одамларда айланиб юрувчи факторлар бўлиб, улар мавжуд бўлган пайтда эритроцитларда инсулинли боғланишнинг пасайиши руй беради. Бу холат гипергликемиянинг турли формалари мавжуд бўлган шахсларда кузатилмайди. Рецепторлар дефицити, эхтимол, уларни инсулинга ўхшашлигини ҳисобига тўлдирилади. К.К. Gambhir ва V.R. Agarwal (1991) эритроцитларда гипергликемия шароитларида инсулин рецепторларининг бузилишини таъкидлаб ўтишган. Бу ҳолат генетик ёки илгаридан мавжуд бўлган адаптив характерга боғлик; бўлиб рецепторлар биосинтезининг пасайиши билан тушунтирилади. Шунга ўхшаш маълумотлар В.А. Маслянко томонидан олинган (1986).

Шундай килиб, инсулин  рецепторларининг жойлашуви, тузилиши, хоссалари хакидаги замонавий карашларнинг тахлили икки типдаги инсулин рецепторлари мавжудлигини тахмин килади: сигналнинг кучайиши ва хужайра мембранаси функционал ҳолатининг кучайиши ҳисобига лигандани аниқловчи функциясига эга ва гормонни специфик ушлашни амалга оширувчи, уни хужайра цитозолига интернализациясини амалга оширувчи рецепторлар. Буларнинг хаммаси инсулинни уз самаралари хисобига амалга ошишига замин яратади.

Хужайра плазматик мембранаси рецепторларининг инсулинни специфик боғланиши ва парчаланишидаги роли. Муайян бир давр давомида инсулинни протеолизи гормонни нишон-тўқима хужайралари билан кантакти натижасида рўй беради ва хужайра мембраналарининг специфик рецепторлари билан боғланмайди деб ҳисоблаб келинган [30]. Хозирги давр да исталган гормоннинг хужайрага таъсирининг бошланғич босқичи бўлиб, уни плазматик мембрана юзасида специфик рецепторлар билан боғланиши хисобланади [31,32,33].

Рецептор боғланаган нсулиннинг кўп қисми эндосомаларда интернализацияланган. Бунда гормоннинг эндосомал деградацияси эндосомал пуфакчаларда оксидланиш жараёнларидан олдин инициирланади. [34,35,36] ва бундан кейин деградация махсулотларининг миқдори ошади. Гепатоцидларда гормонни рецептор билан боғланиши инсулин парчаланишини фаоллаштиради, масалан хужайрани СС1₂, билан зарарланиши рецепторларни специфик лигандларга ўхшашлигини пасайтиради ва шу билан бир пайтда унинг деградацияси тезлигини пасайтиради. Протеолизнинг лизосомал йули фойдасига [¹²⁵J] инсулиндан радиографик тадқиқотларда фойдаланиш натижалари гувохлик беради [37], натижада ажралиб чикқан инсулин цитоплазмага ва протеиназалар таъсирига учрайди.

Шундай килиб, инсулинни хужайрага таъсири  физиологик жавобга, гормоннинг тезда  парчаланишга олиб келади. Рецептор билан боғланган инсулинни структуравий ўзгариши аниқланган. Аникданишича, инсулин рецептори, гормоннинг ўзи сингари эндоцитоздан олдин ёки шу жараён ичида турли ўзгаришларга учрайди [38,39,40]. Нормада эритроцитларда инсулинни боғланиши ва парчаланиши бу гормонни қондаги концентрацияси билан корреляция     қилинади.     Бироқ,     сут    эмизувчиларнинг    гипергликемияли эритроцитларида инсулин деградацияловчи фаолликни ошиши кузатилади. Бироқ хужайраларнинг ҳамма типи хам инсулинни уни боғланишдан кейин парчалаш қобилиятига эга эмас. Масалан сут эмизувчилар аортасининг эндотемиал хужайралари инсулин рецепторига эга ва булар бошқа хужайраларнинг рецепторларига ўхшашдир, бироқ улар томонидан гормоннинг парчаланиши жуда секин руй беради [41]. Хайвонлар ва одам қонида инсулин даражасининг ўзгариши бир катор хужайраларда инсулин рецепторларининг мавжудлигига таъсир килади. Масалан, стрептозотоцин диабетли каламушларда жигар ва скелет мушаклари хужайралари мембранасининг инсулинни бириктириб олиш хусусияти бор[42]. Бирок инсуляр етишмовчилик гормонларни у учун специфик рецепторлар билан гормонларни нормал ёки кетган боғланишида юзага чиқиши мумкин. Рецепторларни инсулинни боғлаш кобилияти мембрана оксилларини фосфоримерланиши ҳисобига бошкарилади, бунда АТФ инсулин боғланишига модуляр таъсир кўрсатади. С.А. Моренкова ва А.А.Каралинлар (1980) нишонланган инсулинни жигар ва мушак тўкимаси цитоплазматик мембранаси рецепторлари билан специфик боғланиши экспериментал стрептозотоцинли (СЗТЦ) диабетли хайвонларда назоратдагиларга нисбатан ошганлигини кўрсатиб беришган.

Проинсулиннинг кимёвий хусусиятлари

Инсулин ошкозонининг бетта хужайраларида нофаол олд  бирикма сифатида синтез қилинади. Унинг бевосита олдбирикмаси 1966 йил Д.Стайнер кашф этган проинсулин-бир занжирли полипептид, молекуласида хайвон турига караб 78 дан 86 тагача аминокислота тутади, корамол ошкозоности безининг проинсулини 81 та аминокислота колдигидан ташкил топган, у занжирлараро учта дисульфид кўпригига эга[3].

Проинсулин  структурасида инсулинни А ва В занжирлари орасида 33 та аминокислота колдиғидан иборат кўшимча пептид жойлашган. У занжирнинг С учи томонида жойлашганидан "С пептид" номини олган. Проинсулин оролча тўқиманинг бетта хужайралари ичида доначаларда тўпланади ва унга эхтиёж туғилгани ҳакида сигнал келмагунча сақланиб туради. Шундай сигнал келиши билан проинсулин молекуласи специфик пептидазалар таъсирида фаол инсулинга айланади. Бу жараён проинсулин молекуласининг икки жойида пептид боғлари узилиб унинг ўртасида бир фрагментининг кесиб олиниши билан боғлиқ. Сўнгра пептидаза бу фрагментнинг хар икки учидан иккитадан аминокислота қолдиғи кесиб ташлагач, С пептид ҳосил бўлади. С пептиднинг бирламчи структураси инсулиннинг А ва В занжирларидаги аминокислоталар тартибига қараганда кўпроқ ўзгаришларга дучор бўлиб туради. Лекин инсулиннинг бошланғич олд бирикмаси проинсулиндан ташкари унинг N учида 23 аминокислота қолдиғидан ташкил топган лидер ёки сигнал занжир сақловчи препроинсулин эканлиги тасдиқланган. Проинсулин ҳосил бўлганда бу сигнал пептид махсус пептидаза таъсирида ажралиб чиқади. Бу мухим биологик жараённинг механизми ҳали тўлиқ ўрганилмаган.

Инсулин юқори гетерогенлиги билан фарқ қилади ва унинг манбаалари бири оқсилли моддалар коришмаси ҳисоланади. Улар инсулинга хусусиятлар жихати яқин, бироқ инсулин бўлмасликлари лозим. Ушбу моддалар турли объектлардан олинган, криссталли инсулин, ошкозон ости безининг оролчаларидан, қондан ва хакоза. Бу моддалар инсулин аждодлари ёки проинсулиндир. Инсулиннинг бир халқали проинсулин борлиги хакддаги ғояни биринчи бўлиб, Гивол киритган. Ушбу моддани топишга Ванд хам уринган. Кеийчалик     бир     катор     тадкикотчилар     томонидан     Г-50     сефадексида аниқлаштириш йўли билан оқсилли модда ишлаб чикарилган. Хўкиз ва чўчканинг кристалли инсулинага эритма сифатида. У инсулиндан молекуляр вазни (9100-9300) билан фарқланса ва паст инсулин фаоллиги билан хам фаркланади. Проинсулин фракцияси инсулиндан кейин топилган.

1.6.    Эритроцитлардаги инсулиназа ферментини ажратиб олиш ва

хусусиятларини ўрганиш

Инсулин деградацияловчи ферментларнинг характеристикаси ва функцияси. Инсулин деградацияси жараёнлари гормонга унинг утилизациясига хужайра жавобининг пасайишини такозо этади [44,45]. Бунда инсулиннинг биологик функциясини амалга ошишида асосий ролни инсулин специфик протеазалар-инсулиназалар ёки цитозол металлоэнодпептидазалар ўйнайди [30]. СМ. Лейтес (1959) таъкидлашича, тўкималарнинг инсулиназали фаоллиги инсулин деградациясига йўналган булиб, 1929 йилдаёк, А.А. Шмидт ва Р.Л. Саатчиан томонидан таърифлаб берилган. Инсулиназа ферментнинг ўзи 1949 йилда LA. Mirsky ва R.H.Broh-Kahn томонидан ажратилди ва тозалаб олинди, бирок тозалаш ўша пайтида муваффакиятсиз бўлди. Улар томонидан ажратиб олинган инсулин деградирловчи фермент (ИДФ) турли хил протеазалар аралашмаси бўлиб, улар хозирги даврда идентификацияланган инсулин протеазаси, инсулин специфик протеаза, инсулизин ва инсулиназа [45,46]. Масалан, R.A.Roth лабороториясида инсулиназанинг комплементар ДНКси олинди ва ИДФ инсулинли протеиназа ёки инсулиназага ўхшашлиги аникданди [47], улар кўплаб хужайравий функцияларни бажаради. Жумладан: стероид ва протеасомли рецепторлар фаоллигини бошкаради, инсулинни функционал таъсирини ва ўсишнинг эпидермал факторини бошкаради, амилин клиренцида катта ахамиятга эга, хужайравий ўсиш ва ривожланиш билан боғлиқ бўлган муайян функцияларни бажаради.

ИДФ асосан хужайра  цитоплазмасида жойлашган бироқ у плазматик мембраналарида хам топилган. Масалан, S.Ansorge ва муаллифлар (1984) нинг таъкидлашича, жигарда инсулин деградирловчи ферментлар фақатгина паренхимат ферментоз органларда жойлашган. Бунда инсулиннинг хоссаларида сезиларли даражада турга доир фарқлар аниқланган. W.C.Dukvorth ва хам-касб муаллифларнинг кўрсатишича дрозофиллада инсулин ферментларнинг гомологи хисобланган нсулинга ўхшаш гормонлар мавжудлигини кypcaтади. M.P.Stoppi (1988) инсулин деградацияси специфик нолизосомал инсулиназа билан иницирланишини аниклади. Хужайрлар дефференциасининг маълум бир босқичларида инсулиназа фаоллиги баланд, кейин эса бу жараёнларнинг тугалланиши билан пасаяди. К.С.Шегкп ва хамкасб муаллифлар (1994) чўчка скелет мускулатурасини инсулиназасини ўргана туриб, мазкур инсулин молекуласини деградацияга учратишни таъкидлаб ўтишган. Сал олдинрок, W.C.Duckworth (1989)нинг изланишларида инсулин деградациясининг хоссалари ва махсулотларининг ўхшашлиги кўрсатиб ўтилган. Унинг фикрича, олинган махсулотлари инсулиназани унинг хужайравий функцияларини амалга ошириш учун эволюцион сақланиш гипотезасини исботлади. Y.E.Cheng ва D.Zipser (1979), A.A.Pierotti билан хаммуаллифлар ва V.Chesneau билан хаммуаллифлар (1994) каламушнинг мия ва тестостинал тўкимасидан металлоэндопептидазалар оиласига мансуб икки асосли конвертазани аниқлашган ва мазкур фермент 35% га Escherichia coli (ЕС 3.4.99.44) нинг протеиназа III билан 48% га каламуш ва одам инсулиназаси билан ўхшашлиги маълум булди. A.B.Becker ва R.A. Ronh (1995) инсулизин (ЕС 3.4. 22. 11, инсулиназа) ва питрилизин-сут эмизувчи ва бактерияларнинг инсулин деградирловчи ферментини тадкиқ қилишди ва юқоридаги эффектларни ўхшашлигини аниқлашди [48]. Аниқландики, кўпчилик тўқималарнинг лизосомал инсулиназасининг молекуляр массаси 110 kDa ва цинк боғлиқ металлопротеиназа эканлиги аникланди [48, 49, 50, 47].

K.Shii билан хаммуаллифлар мушак, жигар, буйрак, мия тўкималари ва эритроцитларнинг цитозол экстрактлари юксак инсулиназа фаоллигигига эга эканлигини кўрсатишди. Кейинчалик R.A. Me Kenzil, G.A. Burghen (1984) ва Л. И. Солопуб ва бошқалар (1989) каламуш жигар ва эритроцитларининг плазматик мембранасидан Mr kDa ва рН 7.6 да оптимум активликка эга инсулин деградирловчи нейтрал протеиназани тоза ҳолда ажратиб олишди. V.Chesneau (2000) Mr 110 kDa га инсулиназани металлоэндопептиза деб ҳисоблашади негаки мазкур фермент эндоген ва синтетик α- пептидларни молекулани муайян участкаларида деградирлаш қобилиятига эга. 1980 йилда HJ.Kolb ва Estandi протеазани одам эритроцитларидан тозалаб олишди. Мазкур фермент гомоген бўлган ва Mr 150-160 kDa бўлган. Эритроцитларда бу ферментнинг битта изоформаси устунлик қилса, жигар хужайралари ва муртак хужайларида иккинчи формаси устунлик килади. [53] Кейинчалик К. Shii (1986) одам эритроцитлари гемолизатидан Mr 110 кДа ли инсулиназани ажратиб олишди. Ажратиб олинган ферментнинг оптимуми рН 7.0 га тўғри келиб у инсулинни гормоннинг β-занжирига нисбатан тезроқ деградация қилган. J.R. Crossley ва R.B.Elliott (1975) фракциялаш йўли билан инсулинсимон модда ажратиб олишди ва уни инсулинспецифик инсулиназага сезгирлигини текширишди ва мазкур фермент инсулиназа таъсирига сезгир эканлиги аникланди.

1986 йилда В.А. Матулавичюс биринчи марта одам эритроцитлари тўлиқ инсулин деградацияловчи комплексга эга эканлигини кўрсатиб беришди. У Mr 100 кДа ли инсулиназа, ингибитор ва активатордан ташкил топган. Бу кейинчалик бошка тадкикртларда ўз исботини топди [51,52,54,56].

G.Bellomo билан хаммуалифлар (1981) қайтарилган глутатионни эритроцитлар мембранасининг инсулиназа фаоллигига таъсирини баҳолашди ва деградациянинг юқори эритроцитларининг мембранасида инсулин деградациясининг ферментатив глутатион - боғлик, тизими мавжуддир. Айнан шу муаллифлар эритроцитлар гемолизатининг инсулиназа фаоллиги ўзининг кўрсаткичлари бўйича эритроцитлар мембранаси учун юқори эканлигини аниклашди [51,55]. Бунда эритроцитлар гемолизати инсулиназасининг инсулин деградацияловчи хоссалари рН 9.0 да сезиларли пасайса рН 9.5-10.0 да ошади. [57] ва уз хоссалари билан юксак тозаланган эритроцитлар инсулиназаси билан фарқ килади [53].

В.А Матулявичюс [58] эритроцитлар гемолизатидан инсулиназа фаоллигига эга Мr тахминан 100 кДа ва Mr тахминан 300 кДa олигомерни ажратиб олишди. Иккинчи инсулиназани субстрати натив инсулин эмас, балки гормоннинг ажралган α- ва β- занжирлари ҳисобланади. Биринчи марта одам қони инсулиназа фаоллигини оригинал радиофермент субстрат методи ёрдамида B.C. Йонушас ва хаммуаллифлар (1986) томонидан соғлом одамларда мазкур кўрсатгичнинг нормал тебранишларини аниқлашди. Қон инсулиназа фаоллигининг ошиши инсулинга боглик; бўлмаган КД характерли хусусияти хисобланади. Бир катор потологик холатларда (кандли диабет, гипертония, ўткир ярали инфекция) инсулин гормонал самарасининг пасайиши кузатилади [62]. K.K.Gambhir ва S.G. Nerurkar (1988) одам эритроцитлари гемолизатини инсулиназасини аммоний сульфат фракциялаш ва гел устун хромотографияси каби анъанавий методлар ёрдамида тозалашни амалга оширишди ва унинг фаоллигини ТХУ кислотасини чўктириш методи билан баҳолашди ва бунда Mr 160 кДа ли фермент инсулин учун тор специфик хисобланади ва рН оптимирли 7,4-7,8 диапозонида бўлади. Сут эмизувчилар эритроцитларининг инсулиназа фаоллиги 3 та гомологик суббирликка эга  Mr 300 кДа бўлган ферментга боғлиқдир [60,61]. Шундай қилиб, инсулиназа физиологик шароитларда димер ёки тример кўринишда мавжуд бўлади ва инсулинни α- ва β- занжирларда парчалайди. A.Safovi ва хаммуаллифлари (1996) ва V.Chesneau ва M.R.Rosner (2000) инсулиназа турли даражадаги мураккабликка эга мультимерлар ҳосил килиши мумкин. Унинг максимал фаоллиги рН 8,6 да кайд килинган. J.A. Aftholter билан хаммуалл. (1988) инсулиназа ДНК сини ажратиб олиб у 13 та пептиддан иборатлигини кўрсатиб беришган. 1991 йилда R. Espinosa билан хаммуаллифлари соматид хужайраларни гибрид анализи методи ёрдамида инсулиназа цитозоль протеиназа эканлигини ва унинг синтези одам хромосомасининг 10-жуфти билан билан кодланишни аниклашди. Хозирги пайтда учта инсулин дерадирловчи тизимлар мавжуд тиолпротеиндисулъфидоксиредуктоза, нейтрал инсулин-деградирловчи протеиназа ва лизосомал протеазалар. Тиолпротеиндесульфидоксиредуктаза жигарни 90% га гомогенлаган пайтда микросомалар фракциясида жойлашади. Нейтрал инсулиндеградирловчи протеиназа жигарнинг эрувчан фракциясида жойлашади. Унинг фаоллиги бощқа барча нейтрал протеазалар фаоллигидан бир неча марта юқоридир.

R.G.Bennett      билан      хаммуалл.( 1994)      таркибида      инсулиназа     ва мультикаталитик    протеиназа   (МКП)   мавжуд   бўлган    цитозолли    оқсил парчаловчи комплексни ажратиб олинди. Ҳозирги пайтда инсулиназани нишонланган гормон ва ТХУ кислота билан деградация махсулотларини чўктиришдан фойдаланиш билан инсулиназани тозалаш ва ажратишнинг турли усуллари яратилган. W.L. Kuo билан хаммуалл. (1991) ортиқча микдордаги нишонланмаган инсулин киритилганда инсулиназа фаоллигининг ошиши ва инсулин деградацияси жараёнининг фаолланиши хужайрани гормон билан ортиқча боғланишни олдини олиш учун руй беради. Улар инсулиназа хужайра чегарасида фаоллашишини кўрсатиб беришган. F. Authier билан хаммуалл. (1994) инсулинни инсулиназага эмас, балки кислотали тиолметаллопротеазага боғлиқ эндосомал протеолизини тадқиқ қилишди.

Нормада ва гипергликемияда каламуш эритроцитларининг

 инсулиназа  фаоллиги

Маълумки, инсулин  протеолизи гормонни хужайра мембранаси юзасидаги специфик рецепторлар  билан алоқаси натижасида амалга ошади. [58]. Протеиназалар таъсири остида ажралаётган инсулин цитоплазмага киради ва специфик инсулиназалар таъсирига учрайди.

Инсулиназа  фаоллигини аниклашнинг иммунофермент методикасига техник талабларни ишлаб чикишда 1:10 нисбатда кон гемолизатини инкубациясини оптимал даври 60-90 мин ташкил этади деган хулосага келдик. Бу интерваларда гормон деградациясининг динамикаси тўғри чизиқли характерга эга бўлади. Модификацияланган иммунофермент методи ёрдамида 32 та тажриба хайвонига эритроцитларнинг инсулиназа фаоллигини аниқладик. Кузатишларда бу киймат нормада 93,70%ни ташкил этиши топилди.

Шу билан бирга тажриба хайвонларида 10 суткада инсулиназа фаоллигининг ошиши кузатилди. Бу кўрсатгич ўртача 111,68% ни ташкил қилди. 20-нчи ва 30-нчи суткада инсулиназа фаоллиги 33% ва 54% га тушган. Бир қатор тадкикотчиларнинг таъкидлашича бу инсулиназа ингибиторларини фаоллигини пасайиши билан боғлиқ [59]. Гипергликемиянинг ривожланиш давомида эритроцитлар инсулиназа фаоллигининг пасайиши хакидаги маълумотлар олинди. Тахмин қилишларича бу эритроцитларнинг анти инсулиназа фаоллигини ошиши билан боқлиқ. Оригинал иммунофермент методи ёрдамида бу эритроцитларни инсулиназа фаоллигини соматик патологияга эга бўлмаган ва физик, психологик параметрлари жиҳатидан ёшига мос келувчи болаларда ўрганилди. Натижада нормада оч қоринга бу курсатгич 95% ни ташкил этиши аниқланди.

Биоспецифик хроматография

Биоспецифик ёки  аффин хроматографияси баъзи  биополимерларнинг табиий биоспецификлигига  асосланган хроматография туридир. Бу усул билан ўзаро биоспецифик боғ ҳосил қилувчи моддаларни эритмалардан ажратиб олиш имконини беради, айникса ажратилаётган модда концентрацияси жуда хам паст (1 мг/мл гача) бўлганда қулай. Бунда моддаларнинг ажратилиши иммобилланган ташувчи билан эритмада эриган модданинг специфик боғ ҳосил қилиши натижасида эришилади.