Иммунобиологик ва микробиологик препаратлар технологияси мутахассислиги

 

№			1	2	3	4	5
		Солиштирма
		0	20	10	10	t0	10
	Оксил	0	120	90	12	6,5	4,6
	микдори,
	мкг/мл
	Д750	0	0,3	0,22	0,3	0,17	0,08

 

Ювинди пробиркаларга  солиниб, оқсил миқдори аниқланди. (2-жадвал). Натижада инсулин ювинди микдори қуйидагича бўлди. Жами: 379.1 мг инсулин ювилган. Бошлашғич инсулин оқсил миқдори билан ювинди оқсил миқдорини айирмаси қанча инсулин инкубация бўлганлиги аниқланади.

1мл – 120 мг 

 

      2,2мл-х=264мг 4500-379.1=4130.9 мг демак, шунча инсулин инкубация бўлган.

 

3.2 Лизатдаги оқсил миқдорини аниқлаш

Лизатдаги оқсил миқорини аниқлаш учун Лоури усулидан фойдаланилди. Лизатни олиш учун одам қонини 10 г олинди. Қонни эритроцитини ажратиб олиш учун 45 минут центрифугага қуйилди.

 

3-жадвал. Лизатдаги оқсил миқдорини аниқлаш. Лоури усули.

 

№		Солиштирма	1	2	3	4	5	6
		0	10	50	100	250	500	750
Суюлтириш Лизат  мл	Оксил микдори, мкг/мл	0	1	2	1	1	1	1
		0					290 мг
	Сув, мл	0,5	9	4	2	4	4	2
	Д750	0		0,41	0,31	o,17	0.1	o,075

 

Плазма қисми ажратилиб, қуйук, кисмини NaCl 0,9% ли билан 5 мл дан олиб 5 марта 5 минутдан центрифугага қуйиб ювилди. Ювилган эритроцитни лизат бўлиши учун 5 мл дисстилланган сув солиб чайқатилади. Биз олган лизатдан 1мл олиб, суюлтириб оқсил миқдори аникланди. (3-жадвал) Натижада 1мл лизатда 290 мг оқсил борлиги аниқланди. 580×500=290000мкг ёки 290мг демак 1 мл лизатда 290 мг оқсил бор. Лизатни субстрат яъни инсулин билан инкубация қилгандан кейин, сорбент ювилади. Инкубациядан сўнг лизатни ўзини пробиркага солинади. Лизат олиниб сорбентни 4 марта 10мл дан (40мл) фосфат буферда (0,02М рН7,4) ювилади. Ювиндини пробиркаларга олиб оқсил миқдори аниқланади. Биз лизатдан Змл солдик. Бу 870 мг оқсил солинди дегани, чунки 3x290=870 мг бўлади.

 

4-жадвал.Лизат ювиндидаги оқсил миқдорини аниқлаш. Лоури усули.

 

№			1	2	3	4	5
		Солиштирма
		0	40	50	6	6	5
Суюлтириш	Оксил	0	0,25	0,5	1	1	0
Лизат мл	миқдори,
	мкг/мл
		0	222,5	105,6	19,8	14,4	1,4
	Сув ,мл	0,5	10	20	5	5	5
	Д750	0	0,13	0,08	0,065	0,055	0,04

 

Ювиндиларни оқсил миқдори аниқланганда қуйидагича бўлди. 225.6+105.6+19.8+14.4+1.4=360.8 мг оқсил ювилиб кетган. Бошланғич оқсил миқдоридан ювиндидаги оқсил микдори айириб ташланса, қанча лизат инкубация бўлганлиги анқиланади. Демак, 870-360,8=469,2 мг лизат инкубация бўлган. (4-жадвал).

Сорбция боскичи  тугагандан кейин десорбция қилинади. Бунда фосфат буферини рН 10,5-11 га чиқариб 30 минут тутиб турилади. Вақт тугагандан кейин бирдан буферни хлорид кислота ёрдамида рН 7,4 га туширилади. Бунда фермент ажратилади ва уни Лоури усулида оқсил микдори аникланади (5-жадвал). Ажратилаган фермент микдори қуйидагича 0,00175 ×30=0,053мг исулиназа ферменти ажратиб олинди.

 

5-жадвал.Ажратиб олинган фермент микдорини аниклаш.

№		Солиштирма	1
		0	30
	Оксил микдори, мкг/мл	0	0,053
	Д750	0	0,00175

 

3.3 Ажратиб олинган фермент фаоллигини аниклаш. Ансон усули

1 мл субстрат ва 1 мл фермент эритмаси 1 соатга инкубацияга қуйилади. Сўнгра   аралашмага   реакцияни   тўхтатиш   учун   0.3   М   ли   трихлоруксус кислотаси ёки этил спиртидан қўшилади. 20 дақиқадан сўнг аралашма фильтрланади. Олинган фильтратдан 0.2 мл дан пробиркага олиб, унга 0.5 М ли натрий карбонат эритмасидан қўшилади. Тезда аралашмага Фолин реактивидан қўшилади. 30 дақиқадан сўнг ФЭК да оптик зичлик аниқланади ва қуйдаги формула орқали протеолитик фаоллик ҳисоблаб топилади. (6 - жадвал).

 

 

 

 

 

 

 

 

6 –  жадвал. Ажратиб олинган фермент фаоллигини аниқлаш.

 

Тозалаш босқичи	Оқсил, мг	Активлиги, умумий йиғинди (ЕД)	Активлиги спецефик (ед/мг оқсил)	Фаоллик бўйича чиқиш (%)	Тозалик даражаси
Гемолизат	870 мг	43.5	0.054	-	1.0
Аффин хромотография	0.053	21.75	197	50%	3940

 

А = (Д·0.8)/(1.72·60· m)

Бу ерда:

Д- фотоэлектроколориметрда ўлчанган оптик зичлик;

0,8- учхлор сирка (УХУ) кислотаси кўшгандан кейин фермент эритмаси ва реакцион аралашмаларнинг хажмий муносабати;

1,72-даражаларга    бўлинган    кийшик    чизик,    бўйича    аниқланадиган инсулиназали коэффициент;

60-субстрат гидролизининг вакти, минут;

m-протеолизга олинган фермент препаратининг миқдори (1мл фермент эритмасига мг.да) ёки мг ларда олинган иммобилланган фермент миқдори.

 

 

III боб бўйича хулоса

Шундай қилиб, инсулиндаги оқсил миқдорини  аниқладик ва хисоб китобларини  бажардик. Шундан кейин лизатдаги  оқсил миқдорини аниқладик. Бунда  Лоури усулидан фойдаландик. Ажратиб  олинган фермент фаоллигини Ансон усулида аниқладик ва хисоб – китобини бажардик.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ХУЛОСА

 

1. Полиамид асосида фаоллашган биоспецифик сорбент синтез килинди. Лиганд   сифатида   одамдан   ген   инженирия   йўли   билан   олинган инсулини (Actrapid novo nordisk) биоспецифик сорбент олиш учун ишлатилди.

2.  Олинган биоспецифик сорбент инсулиназани олишда биоспецифик хромотография жараёнида фойдаланди. Эритроцитдаги ИДФ ини олиш схемаси ишлаб чиқилди. Ажратиб олинган фермент микдори 0,053 мг га тенг.

3.  Иммобилланган инсулин ўз ферменти ИДФ билан парчаланмаслиги аниқланди.     Инсулин     асосида    олинган     биоспецифик     сорбент хромотография жараёнини амалга оширишда ярайди.

4. Эритроцитдаги инсулиназани ва жигардаги инсулиназани идентиклик хақида маълумотлар хозирча етарли эмас.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Қисқартма сўзлар

ИДФ -  инсулин  дегидрловчи фермент

АТФ -  аденазинтрифосфат

ҚД    -  қандли диабет

УХУ – учхлоруксус  кислотаси 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ИЛОВА

Олинган натижалар  асосида калибровка (солиштириш) чизиғи чизилди.

  Буқа қон  зардоби альбумини ёрдамида калибровка  чизиғи келтирилган.

 

 

 

 

 

 

 

 

Схема 2. Каламуш  эритроцитдаги инсулиназани активлигини  рН га боғлиқлиги

Бу ердан  қўриниб турибдики, эритроцит лизатидаги инсулиназани фаоллигини максимал даражаси рН 7.8 да, қолган рН 7.0 да ва рН 8.0 да бирдан чизиқ пастга тушиб кетмоқда.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ФОЙДАЛАНИЛГАН АДАБИЁТЛАР.

1. Туракулов. Ё. X. "Биохимия". Узбекистан 1996 йил.

2. Проблемы биологии и медицины. 2010, №1 (53).

3.  М.И.Плехан. "Химический свойства методы выделения очистки и анализа белковых гормонов. Москва «Медицина».

4. Galbraith R.A., wise c , Вше M.G., Insulin binding and response in erythroblastic leukemic cells //Diabetes.- 1990.- Jul.- vol. 29.- № 7.- p.571- 578.

5. Gluszek J., Szczesniak L., Banaszak F., Tykarski A., Rychlewski T.

Insulin binding to erythrocyte receptors in in patients with essential

hypertension //Pol. Arch. Med. Wewn.- 1999.- vol. 101., № 3.- p. 191-196.

6.Nerurkar S.G., Gambhir K.K., Butterfield R., Сruz I.A., Hosten A.O.,

Dillard M.G. Metabolisrn of inulin in erythrocytes from renal failure patients on

maintenance hemodialysis //Uremia.- Invest- 1984-1985.- Vol. 8.- №  2.- p.

103-109.

7. Rabkin R., underhalter s.A., Duckworth W.W. Effect of prolonged uremia on insulin metabolism by isolated liver muscle //Kidney Int.- 1979.-Vol. 16.-P. 433-439.

8. Baba S., Sakai H., Imamura y.,Yokono K., Emi S. Metabolism of insulin and proinsulin //In: Symposium on proinsulin, insulin and C-peptide.-Tokushima, Japan.- 1978.- p.270-2g2.

9. Gambhir K.K., Nerurkar S.G. Characterization of an intracellular instulin-degrading enzyme in human erythrocytes //Biochern. Med. Metab. В i o I - 1988.- Jun.-Vol.39.-№ 3.-p.294-289.

10. Kamieli E. et al. Insulin-stimulated translocation of glucose transport systems in the isolated rat adipose cell // J. Biol. Chem., 1981, 256, 4722.

11. Kahn C.R. The molecular mechanism of insulin action. Annu. Rev. Med., 1985, 36, 429.

12. Kono T. Action of insuiin on glucose transport and cAMP phosphodiesterase in fat cell: Involvement of two distinct molecular //Recent Prog. Horm. Res., 1983, 30, 519.

13. Mingrone G., Peruzzi B. Effects of insulin on hepotic lipid synthesis in alloxan diabetic rats // Exp. Pathol., 1979, № 9, 533-538.

14.  Greco A.V., Mingrone G. The effect of insulin of hepatic lipid metabolism in alloxan diabetic rats //Acta med. romana.-1979.- №4.- P.357-363.

15.  Stentz F.B., Harris H.L., Kitabchi A.E. Characterization of insulindegrading activity of intact and subcellular components of human fibroblasts // Endocrinology.- 1985.-Vol. 116.-P. 926-934.

16. Cuatrecasas G., Hollenberg M . Binding of insulin and other hormones to nonreceptor materials: saturability, specificity and apparent “negative cooperativity” //Biochem. And Biophys. Res. Communs.-1976.- Yol. 62.-bI.-P. 31-41.

17.  Старосельцева Л.К. Молекулярные основы механизма действия инсулина //Ж.Всесоюз.хим.общ. им Д.И.Менделеева, 1973.-№2.- С.173-182.

18.  Soler A.P., Thompson K.A., Smith R.M., Iarett L. Immunoiogical demonstration of the accumulation of insulin, but not insulin receptor in nuclei of insulin-treated cells //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989.- Vol. 86.- P. 6640-6644.

19.  Старосельцева Л.К. Гормоны поджелудочной железы //Биохимия гормонов и гормональная регуляция. М., 1976.- С. 123-126.

20.   Кузнецов С.А. Эритроцитарное депо инсулина - новое звено в механизме адаптации        организма        к        интенсивным        мышечным        нагрузкам //Тез.докл.Всесоюз.конф.:  Проблемы оценки  функциональных возможностей человека и прогноз здоровья. М., 1985.- С.238.

21. Svabova E., zorad s., Mitkova A., Klimes L, Macho I. Increasing insulin binding and degradation in isolated human erythrocytes with n-heptane and n-hexane and the effect of trypsin and dithiothreitol //Bratisl. Lek. Listy.-1987.- Dec- Vol. 88.- J\1b6.- p. 615_624.

22. Матулявичюс В.А. Изучение количества иммунореактивного инсулина в Гемолизате эритроцитов у лиц с нарушенной толерантностью к глюкозе. Автореф. дне.-.канд. мед. наук. М., 1984.- 28 с.

23. Маслянко В.А. Инсулиндепонирующая функция эритроцитов при хроническом активном гепатите. Дне.канд.мед.наук. Черновцы, 1986.-204 c.

23. Маслянко В.А. Инсулиндепонирующая функция эритроцитов при хроническом активном гепатите. Автореф. дне.канд. мед. наук. Львов, 1986.-20 c.

24. Garnbhir K.K., Juanita A. Archer., carole J., Bradley M.D., washington D_'C_' Characteristics Of Human Erythrocyte insulin receptops //Diabetes.- 197g Jul.- Vol. 27.- Np7._- p. 701-708.

25. Singer S.J., Ash J., Roth R.c. Transmembrane interaction and the mechanisms of transport of protein across membrane //J. suramol. Struct.-1978.- Vol. 9.- Ilb3.- p. 357-373.

26. Hollenberg M.D., cuatrecasas p. Membrane receptor and hormon

action: recent developments //Progr. Neuro-Psysho-pharmacol- 1,978.- Vol. 2.-№3.-P.

287-302.

2T. Bergeron J.M., Searle N., Khan M.N., Posner B.I. Differential and

analytical subractionation of rat liver components intemalizing insulin and

prolacting //Biochemistry.- 1986.- Vol. 25.- P. 1756-1764.

28. Berhanu P. Intemalized insulin-receptor complexes are unidirectionally translocated to choroquine-sensitive degradative sites // J.Biol. Chem.- 1988.-Vol. 263.-P. 5961-5969.