Иммунобиологик ва микробиологик препаратлар технологияси мутахассислиги

Биоспецифик хроматография  ва бошқа адсорбцион ёки ион алмашинув хроматографиялари орасида катта фарқлар мавжуд. Кейинги усулларда аввал эритма таркибидага хар қандай моддалар адсорбцияланади, уларнинг ажратилиши      десорбция      вақтида     амалга      оширилади.      Биоспецифик хроматографияда моддаларни ажратилиши айнан сорбция жараёнида олиб борилади.

Биоспецифик хроматография  олиб боришнинг муҳим масалалари куйидагича: эримайдиган ташувчини танлаш, ташувчига лигандни киритиш, сорбция шароитини танлаш, элюация шароитини танлаш [65].

Маълумки, барча биологик фаол бирикмалар, хусусан ферментлар ҳам лигандлар ёки аффинли лигандлар деб номланадиган бирикмаларга махсус боғланиш хусусиятларига эгадир. Агарда шундай лигандларни инерт матрицага ковалент боғласа фақат керакли ферментни ушловчи ва қолган оқсил ва моддаларни ўтказиб юборувчи махсус адсорбентни олиш мумкин.

Махсус ювувчилардан ёки жараён шароитлари фарқи асосида  лигандни ферментга бўлган хусусиятини  ўзгартириш йўли билан оқсилни десорбцияга  учратиб, тозалаш натижасида битта  юқори тозаликка эга бўлган ферментни олиш мумкиндир. Лекин лиганд ва уни ушлаб турувчини танлаш жуда қийин вазифадир. Кўпчилик ҳолларда аффинли адсорбентларни синтез қилишда тозаланаётган ферментнинг хусусиятларини эътиборга олиш керак.  Аффинли хроматография учун ҳар хил турдаги эримайдиган сорбентлардан фойдаланади, лекин энг кўп тарқалгани кўндаланг қилиб уланган агароза доначаларидир. Улар юқори босимда ўз шаклини сақлайди ва буферларни ҳамда эритувчиларни алмаштиришга бардошлидир.

Лигандлар эса  матрицага шундай боғланган бўлиши керакки, оқсиллар ҳеч қийинчиликсиз уларга келиб боғланиши ва бунинг учун матрица билан лиганд ўртасида кўприкча бўлиши керак. Булардан ташқари лиганд бошқа бирикмалар билан ўзаро боғланмаслиги, факат матрицага боғланган ва ювиш, регенерация жараёнларига чидамли бўлиши шартдир.

I боб бўйича хулоса

Шундай қилиб, қандли диабетнинг пайдо бўлиши кўпроқ инсулинга боғлиқ экан бунга тўхталмай иложимиз йўк. Бу гормон ошқозон ости безидаги Лангерганс оролчаларининг бета хужайраларида ҳосил бўлади. Барча тўкималардаги модда алмашинувига кўп қиррали таъсир ўтказади. Инсулиннинг асосий иши қондаги глюкоза даражасини пасайтиришдан иборат.

Инсулиназа  фаоллигини аниклашнинг иммунофермент методикасига техник талабларни ишлаб чикишда 1:10 нисбатда кон гемолизатини инкубациясини оптимал даври 60-90 мин ташкил этади деган хулосага келдик.

II БОБ.  ТАДҚИҚОТ УСУЛЛАРИ

2.1 Лизат  олиш усули.

Тадқиқот  объекти:

Бу ишда тадқиқот объекти сифатида каламуш қони ва одам инсулинидан фойдаланилди.

Асбоблар:

1.ФЭК – М

2. Центрифуга ТУ 5.375 – 4260 – 76

Реагентлар:

1. Хлорид кислота,
2. Калий гидрофосфат,
3. Калий дегидрофосфат,
4. Калий гидроксид,
5. Глутар диальдегид,
6. Борат буфер (0.1М рН9),
7. Инсулин,
8. Лизат (каламуш эритроцити),
9. Фосфат буфери (0.02 М рН 7.4)
10. Натрий хлор 0.9%.

 

 

Ишнинг  бориши

    Лизат олиш учун 10 гр каламуш қонини олиниб, 10 дақ. совутишга қўйилади. Совутилган қонни олиб пробиркаларга жойлаштирилиб центрофугага 45 минутга қўйилади. Вақт тугагандан кейин пробиркадаги қоннинг суюқ қисми плазмани (5) олиб ташланади. Плазма миқдори қанча чиққан бўлса, шунча ош тузи 0,9%ли 5мл дан олиб 5 марта 5 минутдан центрифугага қўйиб ювилади. Бунда эритроцит тозаланади. Ювилган эритроцитда лизат бўлиши учун 5 мл дистилланган сув солиб чайқатилади. Эритроцит қобиғи 100% ёрилиши учун музлатгичга 24 соатга музлатилади. Шунда музлаган эритроцит эриганда 100% лизат бўлади.

2.2 Оқсил  миқдорини Лоури усулида аниқлаш

  Бу усул  асосида биурет реакцияси (пептид  боғлар) ва Фолин реакцияси (триптофан  ва тирозин аминокислоталар реакцияси)  ташкил қилади. Оқсилни миқдорий аниқлаш усуллари орасида Лоури методи сезгирлиги билан ажралиб туради.

Реактивлар:

1 – Эритма: 0.1М NaOH да (NH₄)₂CO₃ тузининг 0.5% ли эритмаси.

2 –Эритма: 1% лиNa цитрат эритмасида CuSO₄ тузининг 0.5%ли эритмаси.

 эритма аралаштирилади. С – реактив.

4 – Эритма: Фолин  – Чокальтеу эритмаси.

5 – Эритма: оқсилли  эритмалар.

 

 

Ишнинг  олиб бориш тартиби

   5 – эритмадан: Суюлтириш 1:9 нисбатда, 1 мл тозаланган сув, (25:50:100:200) амалга оширилади. 5 та пробиркага олиб хар бир пробиркага суюлтирилган эритмадан 0.4 мл дан қўйиб чиқдик. Устидан 3 – эритмадан 2 мл дан ҳар бир пробиркага солиб ҳона ҳароратида 10 минут қолдирилди. Вақт тугаганда кейин ҳар бир пробиркага 0.1 мл тозалан сув ва 0.1 мл фолин 4 - –ритмадан қўйилади. Сўнг 24 соат давомида хона ҳароратида қолдирилади. Шу вақт ўтгандан сўнг ҳар бир пробиркадаги  эритмаларни ФЭК аппаратида ўлчанади. ФЭКда Д₇₅₀ нм тўлқин узунлигида эритмаларнинг оптик зичлиги аниқланади. Олинган натижалар №1 жадвалда келтирилган. Олинган натижалар асосида калибровка (солиштириш) чизиғи чизилди. Номаълум концентрацияли эритмаларни аниқлаётган ҳам худди шундай фойдаланилди.

  Буқа қон  зардоби альбумини ёрдамида калибровка  чизиғи (илова1) келтирилган.

0.02 М  ли рН 7.4 фосфат буферини тайёрлаш

   рН 7.4 га тенг бўлган 1 М фосфат буферини тайёрлаш учун K₂HPO₄ тузининг 1 М ли эритмасидан 80.2 мл ва KH₂PO₄ тузининг 1 М ли эритмасидан 19.2 мл керак бўлади. 0.02М ли фосфат буфери 1 М ли эритмани керакли миқдорда дистилланган сув билан суюлтириш орқали тайёрланади.

0.1М рН 9.0 Борат буфери

0.1М рН 9.0 борат  буферини тайёрлаш учун 1.24 гр  Н₃ВО ва 1.49 гр KCl озгина сувдв эритилади, сўнг 2.08 мл 1 М NaOH қўшилиб сув билан 100 мл га келтириб олинади. Олинган эритманинг муҳити рН – метрда аниқланади.

 

2.3 Инсулин асосида биоспецифик сорбент тайёрлаш.

  Реактивлар:

1. Полиамид доначалари – 69мг дан.
2. 2 Н ли НСl- 50 мл.
3. 25% ли 0,5 мл глутар диальдегид.
4. 0,1 М борат буфери рН-9,0  500 мл.
5. инсулин
6. Дис сув.

Керакли асбоблар:

1. Спекирофотометр
2. Шиша стакан 100 мл дан 2-3 дона.
3. Ўлчов цилиндрлари 100 мл.
4. Пипеткалар.

Ишнинг  бориши:

1.     Полиамид доначалари массаси аниқланади. 1:14 нисбатда 2 Н ли НСl кислота солиниб 45°С ҳароратли сув ҳаммомида 2 соат қолдирилади ва вақти-вақти билан аралаштирилиб турилади. Сўнгра дистилланган сув бир неча марта ювилади, кислота қолмагунча ва шу асосида фаол гуруҳлар ҳосил қилинади.

2.Сорбентни модификациялаш. Фаоллаштирилган полиамид 30 мл рН- 9,0 0,1 М ли борат буферида ювилади. Кейин 0.03 мл 25% ли глутар диальдигиди эритмаси билан  5 мл рН- 9,0 0,1 М ли борат буфери аралаштириб қўйилади ва 24 соатга хона ҳароратида қолдирилди, вақти-вақти билан аралаштирилди.

3. Сўнгра сорбентдан  глутар диальдегид ҳиди йўқолгунча  сув билан тозаланади. КЕйинги  босқичда модификацияланган сорбентдан 2.5 мл инсулин ва 2.5 мл юорат буфер (0.1М рН9) билан аралаштирилиб солиб, 24 соатга хона ҳароратида инкубацияга қўйилади.

4. Инкубациядан  кейин сорбентни 3 марта 10 мл  дан  (30 мл) тозаланган сувда ювилади  сўнгра 3 марта 10 мл дан (30 мл) борат  буфери (0.1М рН9)ювилади.

5. Сўнг сув  билан бир неча марта ювилади. Сорбент кислоталимуҳитдаги эритма билан ёки буферда 4 дан 20⁰ С ли ҳароратда сақланади.

Сорбент юзасига инсулиназа ферментни сорбциялаш

1.Ювилган полиамедга  фермент ўтириш учун лизат  солиниб, 24 соатга инкубацияга қўйилади.

2. Инкубациядан сўнг лизатни ўзини пробиркага солинади. Лизат олиниб сорбентни 4 марта 10 мл дан (40мл) фосфат буферда (0.02 М рН 7.4) ювилади. Ювиндини пробиркаларга олиб оқсил миқдори аниқланади.

2.4 Инсулиназа  ферменти десорбцияси

1. Сорбция босқичи тугагандан кейин десорбция қилинади. Бунда фосфат буферини рН 10.5 – 11 га чиқариб 30 минут тутиб турилади.

2. Вақт тугагандан  кейин бирдан буферни хлорид  кислота ёрдамида рН 7.4 га туширилади. Бунда фермент ажратилади ва  уни Лоури усулида оқсил миқдори аниқланади.

 

 

 

 

 

 

 

Биосорбент  синтези технологик схемаси

 

2.5 Протеолитик  фаолликни аниқлаш. Ансон усули

     Протеолитик  фаолликни Ансон усулида аниқлаш  қуйидагича амалга оширилади:

     Керакли реактивлар:

1. Субстрат эритмаси.
2. Фермент эритмаси.
3. 0.3 М уч хлор сирка кислота.
4. 0,5 М натрий карбонат тузининг эритмаси.
5. Фолин реактиви.

     Аниқлаш усули: 1 мл субстрат ва 1 мл фермент эритмаси 1 соатга инкубацияга қўйилади.Сўнгра аралашмага реакцияни тўхтатиш учун 0,3 М ли трихлоруксус кислотаси ёки этил спиртидан қўшилади. 20 дақиқадан сўнг аралашма фильтрланади. Олинган фильтратдан 0,2 мл дан пробиркага олиб, унга 0,5 М ли натрий карбонат эритмасидан қўшилади. 30 дақиқадан сўнг ФЭК да оптик зичлик аниқланади ва қуйидаги формула орқали протеолитик фаоллик ҳисоблаб топилади.

 

А=(Д·0,8)/(1,72·60·м)

     Бу  ерда:

     А-  протеолитик фаоллик;

     Д-фотоэлектроколориметрда  ўлчанган оптик зичлик;

0.8- Учхлоруксус (УХУ) кислотаси қўшгандан кейин фермент эритмаси ва реакцион аралашмаларнинг ҳажмий муносабати;

    1,72- даражаларга  бўлган қийишиқ чизиқ бўйича  аниқланадиган тирозинли коэффициент;

     60- субстрат гидролизининг вақти,  минут;

 м-протеолизга  олинган фермент препаратининг  миқдори (1 мл фермент эритмасига  мг да) ёки мг ларда олинган  иммобилланган фермент миқдори.

2 –  схема. Инсулинни ИДФ билан  боғланиши схемаси

II боб бўйича хулоса

Шундай қилиб,  бу бобда тадқиқот обекти каламуш  қонини эритроцитларидан лизат олдик, Лоури усули бўйича миқдорини  аниқладик, инсулин асосида биоспецефик  сорбент тайёрладик ва инсулиназани сорбентга  адсорбция, десорбция жараёнларини ўргандик. Ва протеолитик фаоллигини аниқладик.

 

 

III БОБ. ОЛИНГАН НАТИЖАЛАР ВА ХУЛОСАЛАР ТАҲЛИЛИ

3.1 Инсулиндаги оқсил миқдорини аниқлаш

 

Полиамид бўлакчалари массаси аниқланади, 1:14 нисбатда 2 Н ли HCL кислотадан 6 мл солиниб 45° С хароратли сув хаммомида 2-соат қолдирилади. Сўнгра сув билан бир неча марта ювилади, кислота қолмагунча ва шу асосида полиамид     юзасида          фаол     гурухлар     ҳосил     қилинади.     Сорбентни модификатциялаш: Фаоллантирилган полиамидни сув билан 3 марта 30 мл ювилади сўнг З марта 30 мл рН-9.0 0.1 М ли борат буферида ювилади. Кейин 0.03 мл 25% ли глутар диальдегиди эритмаси билан 5мл рН-9.0 0.1 М ли борат буфери аралаштирилиб кўйилади ва 24 соатга хона хароратида қолдирилади, вақти-вақти билан аралаштирилади. Сўнгра сорбентдан глутар диальдегид хиди йўқолгунча сув билан тозаланади. Кейинги босқичда модификацияланган сорбентдан 2,5 мл инсулин ва 2,5 мл борат буфер (0,1М рН9) билан аралаштириб солиб, 24 соатга хона хароратида инкубацияга кўйилади.

Инкубациядан  кейин сорбентни 3 марта 10 мл дан (30мл) тозаланган сувда ювилади сўнгра 4 марта 10мл дан (40мл) борат буфери (0,1М рН 9)да ювилади. 1-чи инсулиннинг бошланғич оқсил миқдори аникланди. Оксил миқдори қуйидагича бўлди. 900x200=180000мкг =180мг

1. мл  ___________180 мг

2,5 мл ___________ Х=4550 жами 4550мг оқсил солинган (2-жадвал).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1-жадвал. Инсулин миқдорини аниқлаш. Лоури усули.

 

№		Солиштирма	1	2	3	4
		0	20	40	100	200
Суюлтириш Лизат  мл	Оксил миқдори, мкг/мл	0	1	1	2	1
		0
	Сув, мл	0,5	1,9	0,5	2,0	0,5
	Д750	0		0,43	0,22	0,15

 

2-жадвал. Инсулин ювиндидаги оқсил миқдори