Микробиология

Подгруппа III включает БГКП, указывающие на свежее фекальное загрязнение. Отличительная особенность бактерий этой группы — способность расщеплять лактозу до газа при 43–44,5 °С.

Бактерии рода Enterococcus

Все виды и варианты энтерококков имеют санитарно-показательное значение и отвечают целому ряду требований, предъявляемых к СПМ. Энтерококки постоянно обитают в кишечнике человека несмотря на то, что в количественном отношении их меньше, чем кишечных палочек. Энтерококки не проявляют выраженной изменчивости и не имеют аналогов во внешней среде, что облегчает их распознавание. Лишь на растениях обнаруживают похожие на них стрептококки, но эти растительные стрептококки не растут на щелочных средах, используемых для выделения энтерококков. Энтерококки отмирают во внешней среде значительно быстрее, чем Escherichia coli, поэтому они всегда свидетельствуют о свежем фекальном загрязнении. По количеству кишечной палочки и энтерококка судят о массивности свежего фекального загрязнения.

Бактерии рода Proteus

Протеи относят к третьей (по значимости) группе СПМ. Наибольшее санитарно-показательное значение имеют Proteus vulgaris и P. mirabilis. При этом P. vulgaris обычно рассматривают как показатель загрязнения объекта органическими веществами (так как его чаще обнаруживают в гниющих остатках), а P. mirabilis — как показатель фекального загрязнения (так как его чаще обнаруживают в фекалиях). P. rettgeri чаще выявляют в испражнениях при кишечных инфекциях, поэтому его обнаружение свидетельствует об эпидемиологическом неблагополучии. Присутствие протеев в воде, пищевых продуктах, смывах всегда свидетельствует о загрязнении объекта разлагающимися субстратами и о крайне неблагополучном санитарном состоянии. Пищевые продукты, загрязнённые протеем, обычно выбраковывают, а воду, содержащую протей, нельзя пить.

Clostridium perfringens

Для идентификации бактерий предложен энтеритный тест, включающий посев на молоко и обнаружение бурного сбраживания субстрата (“штормовая реакция”). Для дифференцирования клостридий фекального происхождения от клостридий, обитающих во внешней среде, используют среды УЋлсона–Блšра. Кишечные клостридии вызывают почернение среды УЋлсона–Блšра (за счёт восстановления сульфитов), а свободноживущие клостридии не изменяют её цвет (так как не имеют сульфит редуктазы). О давности фекального загрязнения объекта предложено судить по сопоставлению количества споровых и вегетативных форм C. perfringens. С этой целью определяют количество клостридий в непрогретых и прогретых пробах. О давности фекального загрязнения также судят по сопоставлению индекса Escherichia coli и индекса C. perfringens. Высокое значение индекса E. coli и низкое значение индекса C. perfringens указывают на давнее загрязнение. Если оба показателя имеют высокое значение, то это свидетельствует о свежем фекальном загрязнении. В отечественной практике количественный учёт клостридий предусмотрен при исследованиях почвы, лечебных грязей, воды открытых водоёмов.

Термофилы

Термофилы представлены полиморфной группой преимущественно спорообразующих бактерий, способных размножаться при 50–70 °С. Термофилы выделяют с объектов внешней среды, реже из кишечника животных и человека. Во внешней среде термофилы обнаруживают на субстратах, загрязнённых навозом или компостом. В процессе гниения в этих субстратах поднимается температура, оптимальная для размножения бактерий. По количеству термофилов судят о степени загрязнения объекта навозом или компостами. Как индикатор эффективности автоклавирования поиск термофилов также проводят в консервах.

Бактерии рода Salmonella

Сальмонеллы попадают во внешнюю среду только с фекалиями человека и животных. Их обнаружение всегда свидетельствует о фекальном загрязнении. Сальмонеллы не размножаются в почве; в воде они размножаются лишь при высокой температуре и высоком содержании органических веществ (при этом они хорошо сохраняются даже в чистой воде).

Бактериофаги кишечных бактерий (колифаги)

В качестве СПМ используют бактериофаги кишечных бактерий (эшерихий, шигелл и сальмонелл). Колифаги постоянно обнаруживают там, где есть бактерии, к которым они адаптированы. Однако как показатели возможного присутствия патогенных бактерий они имеют ряд недостатков. Колифаги выживают во внешней среде дольше (8–9 мес), чем соответствующие бактерии (4–5 мес), а также способны адаптироваться к другим видам бактерий.

 

Санитарно – микробиологическое исследование воды.

Вода является естественной средой обитания различных микроорганизмов. Различают пресные и морские воды. Пресные воды разделяют на поверхностные, включая проточные (реки, ручьи) и стоячие (озёра, пруды, водохранилища); подземные (почвенные, грунтовые, артезианские) и атмосферные (дождь, снег)

 Микрофлора природных  вод в значительной степени  зависит от их происхождения.

 В подземных водах  содержатся единичные бактерии. Микрофлору поверхностных  водоемов  образуют 2 группы:

1).  аутохтонные (или водные)

2).  аллохтонные (попадающие  извне при загрязнении различных  источников) м/о.

Автохтонная микрофлора – совокупность микрорганизмов, постоянно живущих и размножающихся в воде. Микробный состав воды напоминает микрофлору почвы, с которой вода соприкасается.  К специфической для воды флоре относятся м/о, микрококки, сарцины, Serratia marcesum,  Baccereus, Bac. mycoides, бактерии родов Pseudomonas, Proteus, Leptospira. Анаэробных бактерий в чистых водоемах мало, наиболее часто обнаруживают клостридии.

Аллохтонная м/флора открытых водоемов. Воды поверхностных водоемов открыты для всех видов контаминации (загрязнения). Основной путь микробного загрязнения водоемов – попадание неочищенных городских отходов и сточных вод. Инфицирование происходит также при купании людей, скота и стирке белья. Попадают в воду представители нормальной и условно-патогенной флоры, а также патогенные: сальмонеллы, шигеллы, вибрионы, возбудители туляремии, иерсиниоза, лептоспиры, вирусы полиомиелита, гепатита А, Е и др.

Патогенные м/о участвуют в процессах  самоочищения воды, в которых наблюдается закономерная последовательность зон сапробности (от греч. sapros – гнилой). Под сапробностью понимают комплекс свойств водоема, включая м/о, содержание органических веществ и стадии минерализации.

1. Полисапробная – зона сильного загрязнения. Число бактерий в 1 мл – миллиарды, много кишечный палочек.
2. Мезосапробная – зона умеренного загрязнения, в 1 мл сотни тысяч микробов, кишечная палочка убывает.
3. Олигосапробная – зона чистой воды, в 1 л десятки или сотни микробов, кишечных палочек нет.

 

 

 

Санитарно-микробиологическое иследование питьевой воды

Проводят:

1. Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре
2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий  (ОКБ и ТКБ)
3. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий
4. Определение колифагов

   Пробу отбирают  в стерильную емкость, снабженную  пробкой и колпачком,  после  предварительной стерилизации крана  обжиганием и последующего спуска  воды не менее 10 минут при полностью  открытом кране. При отборе пробы  напор воды  уменьшают.

               1.Определение общего числа микроорганизмов,     образующих   колонии  на      питательном агаре.

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и

 Регулярно исследуют  санитарно-микробиологическими методами:

1. воду питьевую централизованного водоснабжения и местного ( из открытых водоемов или из подземных источников)
2. воду плавательных бассейнов
3. лед медицинский и хозяйственный
4. сточные воды: хозяйственно-фекальные, промышленные, смешанные, также и ливневые воды.

Основаниями для санитарно-микробиологических исследований воды являются:

1. выбор источника централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения и периодический контроль за ним.
2. контроль эффективности обеззараживания питьевой воды централизованного водоснабжения
3. наблюдение за подземными источниками централизованного водоснабжения
4. определение состояния и степени пригодности воды источников индивидуального водопользования
5. наблюдение за санитарно-эпидемиологическим состоянием воды открытых водоемов.
6. контроль эффективности обеззараживания воды плавательных бассейнов.

7.  Проверка качества  и степени очистки сточных  вод.

8.  Расследование водных  вспышек инфекционных болезней.

факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37оС в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.

Проведение анализа. Из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 мл. Вносят по 1 мл воды  в стерильные чашки Петри, затем в каждую чашку вливают 8-12 мл расплавленного и остуженного до 45-49оС питательного агара. Быстро смешивают содержимое чашек на горизонтальной поверхности. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и  инкубируют при температуре 37оС в течение 24 часов.

Учет результатов. Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды. Если на двух чашках наблюдается рост расплывчатых колоний или выросло более 300 колоний, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ /мл – ориентировочно». Если подсчет на чашках невозможен, то в протоколе отмечают «сплошной рост».

Норматив::в 1 мл питьевой воды должно быть  не более 50 КОЕ.

2. Определение общих и термотолерантных  колиформных бактерий.

Метод мембранной фильтрации (основной метод).

Общие колиформные бактерии (ОКБ) – грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37оС в течение 24-48 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают их признаками и, кроме того, способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44оС в течение 24 часов.

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивание посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификацией колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Проведение анализа. При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл. При получении стабильных отрицательных результатов допустимо фильтрация 300 мл воды через один фильтр.

При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличение количества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10,40,100,150 мл воды).                                                    

Фильтры помещают на среду Эндо. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37оС в течение 24 часов. Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 часа.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположительных колоний: темно-красных; красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний  с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:

1) наличие оксидазной активности; 2) принадлежность к Граму (микроскопия  окрашенного по Граму препарата  или постановка теста Грегерсена); 3) ферментация лактозы до кислоты  и газа.

1.Постановка  оксидазного теста  Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2-3 каплями реактива для оксидазного теста (например, 1% водным раствором тетраметил-n-фенилендиамина гидрохлорида ) или  используют СИБ-оксидазу. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое или синее (СИБ-оксидаза) окрашивание штриха. При отрицательной  реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном результате эту колонию их дальнейшего исследования исключают.

2. Определение  принадлежности к Граму. Из оксидазоотрицательной колонии делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена: в капле 3% водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются – реакция отрицательная.

3. Определение  ферментации лактозы.  Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой;

-для подтверждения наличия  ОКБ посев инкубируют при температуре 37оС в течение 48 часов (просматривают через 24 часа);

-для подтверждения наличия  ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до  температуры 43-44оС, и инкубируют при температуре 44оС в течение 24 часов.

Учет результатов. При отсутствии ОКБ и ТКБ на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл». В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число КОЕ ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ  в 100 мл воды.

Вычисление проводят по формуле  X= , где Х – число колоний в 100 мл воды; V – профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет; a – число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.