Гель хроматография

СОДЕРЖАНИЕ

Введение                                                                                                                  4

1 Литературный обзор                                                                                            6

   1.1 Свойства углеводов                                                                                       6

   1.2 Методы анализа и разделения углеводов                                                    9

         1.2.1 Гель-хроматография                                                                            9

          1.2.2 Распределительная хроматография на ионообменных смолах     21

         1.2.3 Хроматография на бумаге                                                                 28

  1.2.4 Газожидкостная хроматография триметилсилильных

           производных сахаров                                                                         29

  1.2.5 Газожидкостная хроматография метиллированых сахаров           29

2 Экспериментальная часть                                                                                  32

3 Безопасность жизнедеятельности                                                                     54

Заключение                                                                                                            60

Cписок используемых источников                                                                      61

ВВЕДЕНИЕ

Углеводы - один из основных компонентов клеток и тканей живых организмов, обеспечивают все живые клетки энергией (глюкоза и ее запасные формы - крахмал, гликоген), участвуют в защитных реакциях организма (иммунитет). Из пищевых продуктов наиболее богаты углеводами овощи, фрукты, мучные изделия (крупы, овощи, фрукты и бобовые). Пища человека состоит примерно на 70 % из углеводов. Углеводы входят в состав лекарственных препаратов (гепарин, сердечные гликозиды, некоторые антибиотики). Повышенное содержание некоторых углеводов в крови и моче служит важным диагностическим признаком отдельных заболеваний (сахарный диабет). Суточная потребность человека в углеводах составляет 400-450 г.

Углеводы входят в состав клеток и тканей всех растительных и животных организмов и по массе составляют основную часть органического вещества на Земле. На долю углеводов приходится около 80 % сухого вещества растений и около 20 % животных. Растения синтезируют углеводы из неорганических соединений - углекислого газа и воды. Углеводы являются очень распространенными природными соединениями, входят в состав растений и живых организмов. В растениях они образуются в результате фотосинтеза [1].

Углеводы относятся к той группе органических соединений, важнейшими представителями которой являются сахариды, крахмал, целлюлоза. Углеводы являются основным источником энергии для поддержания всех функций организма, в особенности деятельности мозга, и необходимы для метаболизма всех остальных питательных веществ. Углеводы синтезируются всеми зелеными растениями, и в организме человека либо усваиваются напрямую, либо откладываются в виде гликогена. Кроме того, углеводы могут формироваться в самом организме из некоторых аминокислот и глицероловой составляющей жиров [2].

Для анализа углеводов используются различные методы. Наиболее перспективным методом разделения углеводов является  метод гель-хроматографии.

    C помощью этого вида хроматографии в институте вирусологии г. Москвы был выделен вирус СПИДА [3].

    Гель-хроматография даёт возможность разделять смеси в зависимости от размера и молекулярной массы молекул веществ.

   Гель-хроматография сравнительно простой и быстрый метод разделения смесей вещества. Он выполняется не только в колоночном, но и тонкослойных вариантах.

   Однако в равной степени гель- хроматография применяется для разделения смеси веществ средней молекулярной массы и даже низкомолекулярных соединений. В этом случае большое значение имеет то, что гель-хроматография позволяет вести разделение при комнатных температурах, что выгодно отличает её от газо-жидкостной хроматографии, требующей нагревания для перевода анализируемых веществ в паровую фазу.

    Разделение смеси веществ методом гель- хроматографии возможно и тогда, когда молекулярные массы анализируемых веществ очень близки или даже равны. В этом случае используется взаимодействие растворённых веществ с гелем. Это взаимодействие может оказаться столь значительным, что сводит на нет различия в размерах молекул. Если природа взаимодействия с гелем для разных веществ неодинакова, это различие можно использовать для разделения интересующих смеси [4].

    Целью дипломной работы является разработка метода разделения и анализа смеси моно-, ди-, полисахаридов.

1 Литературный обзор

1.1   Свойства углеводов

         Все углеводы можно разделить на две большие группы.

         I. Простые углеводы (моносахариды, или монозы). Эти углеводы не подвергаются гидролизу с образованием более простых углеводов. В зависимости от числа углеродных атомов в молекуле моносахаридов различают тетрозы (С4), пентозы (С5), гексозы (С6) и т.д. Если моносахариды содержат в своём составе альдегидную группу , то они относятся к классу альдоз (альдегидоспиртов), если кетонную-к классу кетоз (кетоноспиртов).

         II. Сложные углеводы (полисахариды, или полиозы). Эти углеводы подвергаются гидролизу и образуют при этом простые углеводы. Сложные углеводы в свою очередь делят на :

         1) низкомолекулярные, сахароподобные углеводы (олигосахариды), растворимые в воде и сладкие на вкус;

         2) высокомолекулярные, несахароподобные углеводы (высшие полисахариды), не сладкие на вкус и не растворимые в воде.

         В зависимости от состава сложные углеводы (полисахариды) можно разделить на две группы:

         а) гомополисахариды, состоящие из остатков одного и того же моносахарида;

         б) гетерополисахариды, состоящие из остатков различных моносахаридов [5].

          Классификацию   углеводов   можно представить в виде схемы (рисунок 1).

Рисунок 1 – Схема классификации углеводов

  К наиболее широко применяемым углеводам относятся  сахароза, мальтоза, лактоза, манит, рамноза, дульцит, инозит, арабиноза, глюкоза, фруктоза, инулин .                      

Из группы дисахаридов наибольшее значение имеет сахароза, которая иначе называется свекловичным или тросниковым сахаром. Эмпирическая формула сахарозы С12Н22О11. Велико содержание сахарозы в сахарной свекле и в стеблях сахарного тростника. Она имеется также в соке берёзы, клёна, во многих плодах и овощах. Сахароза (обыкновенный сахар)- белое кристаллическое вещество, более сладкое, чем глюкоза, хорошо растворимое в воде.

  Мальтоза (от англ. malt — солод), солодовый сахар, природный дисахарид, состоящий из двух остатков глюкозы; содержится в больших количествах в проросших зёрнах (солоде) ячменя, ржи и других зерновых; обнаружен также в томатах, в пыльце нектара и ряда растений. Мальтоза легко растворима в воде, имеет сладкий вкус; является восстанавливающим сахаром, так как имеет незамещённую полуацетальную гидроксильную группу [6].

   Лактоза (от лат. lac, род падеж lactis — молоко), молочный сахар, C12H22O11, дисахарид, образованный остатками D-галактозы и D-глюкозы; существует в виде α- и b-форм. Кристаллическая лактоза получена в трёх модификациях: в виде α-формы, tпл. 223 °С, b-формы, tпл. 252 °С, и моногидрата a-формы, tпл. 202 °С. Растворима в воде, разбавленном этиловом спирте, пиридине, нерастворима в эфире и абсолютном спирте; при кислотном гидролизе расщепляется на галактозу и глюкозу. Лактоза присутствует в молоке всех млекопитающих в свободном виде (2—8,5 % ).

   Маннит СН2(ОН)[СH(ОН)]4СН2(ОН) = C6H14O6. Такой же формулой обладают еще дульцит и сорбит. Обладая общей структурной формулой, вещества эти обладают и одинаковой "химической функцией" - это предельные шестиатомные спирты. Структурная формула их доказывается способностью давать при нагревании с концентрированной йодистоводородной кислотой один и тот же вторичный йодистый гексил C6H13J, нормального строения; как шестиатомные спирты, они дают шестикислотные эфиры. Осторожным окислением они переводятся в соответствующие глюкозы, а потому номенклатура их находится в прямой связи с номенклатурой последних. Возможность существования различных веществ, обладающих одинаковой структурной формулой, объясняется здесь стереоизомерией

    Рамноза, 6-дезоксиманноза, моносахарид с общей формулой C6H12O5. Существует в виде оптически активных D- и L-форм и рацемата. Хорошо растворима в воде и спирте, вступает в реакции, характерные для восстанавливающих сахаров. L-изомер найден в растениях в свободном виде, а также в составе многих растительных и бактериальных полисахаридов, растительных гликозидов и др. D-изомер встречается лишь в некоторых гликозидах и полисахаридах микроорганизмов.

    Дульцит или мелампирит, С 6 Н 14 О 6 - это один из стереоизомеров  маннита, шестиатомного предельного спирт, кристаллическое вещество, температура плавления 188,5 °С, удельный вес 1,466, встречается в растительном выпоте — манне [7].

    Инозит - твёрдое вещество (tпл. 225-227 °С) сладкого вкуса, молекулярная масса 180,2; легко растворим в воде, нерастворим в органических растворителях. Широко распространён в растениях, в основном в виде фитиновой кислоты и ее кальциево-магниевой соли (фитин). Для некоторых микроорганизмов инозит - необходимый фактор роста. Суточная потребность в нём человека - примерно 1-1,5 г.

    Арабиноза                      C5H10O5, простой углевод из группы пентоз. Бесцветные кристаллы, сладкие на вкус, растворимые в воде. Существует в двух стереоизомерных формах: (—)-A. и(+)-А., широко распространён в растениях , особенно в плодах. (+)-A. входит в состав многих сложных сахаров полисахаридов растительного происхождения, гликозидов, камедей (гуммиарабик, вишнёвый клей), слизей и сапонинов. Для некоторых бактерий арабиноза — единственный источник углерода.

      Важнейшим из моносахаридов является глюкоза С6Н12О6, которую иначе называют виноградным сахаром. Это белое кристаллическое вещество сладкое на вкус, хорошо растворимое в воде. Глюкоза содержится в растительном и животных организмах, особенно велико её содержание в виноградном соке (отсюда и название виноградный сахар), в мёде, а также в спелых фруктах и ягодах.

    Фруктоза- С6Н12О6 изомер глюкозы, содержится вместе с глюкозой в сладких плодах и мёде. Она слаще глюкозы и сахарозы. Фруктоза является кетоноспиртом [8].

   Инулин (C6H10O5)n — органическое вещество из группы полисахаридов, полимер D-фруктозы . Полифруктозан, который может быть получен в виде аморфного порошка и в виде кристаллов, легко растворимый в горячей воде и трудно в холодной. Молекулярная масса 5000—6000. Имеет сладкий вкус. При гидролизе под действием кислот и фермента инулазы образует D-фруктозу и небольшое количество глюкозы. Инулин, как и промежуточные продукты его ферментативного расщепления — инулиды, не обладает восстанавливающими свойствами. Молекула инулина — цепочка из 30—35 остатков фруктозы в фуранозной форме [9].

1.2 Методы анализа и разделения углеводов

1.2.1 Гель-хроматография

Наиболее перспективным методом разделения углеводов является гель-хроматография.

Хроматографическое разделение смеси веществ в рамках её жидкостно- жидкостного варианта можно проводить не только на основе распределения компонентов анализируемой смеси между двумя несмешивающими жидкостями, но и гель-хроматографией.В отличие от распределительной в гель хроматографии подвижной и неподвижной фазами служит одна и та же жидкость – растворитель. При этом та часть жидкости, которая протекает вдоль слоя твёрдого носителя – зёрен геля, выполняет функцию подвижной фазы и переносит компоненты разделяемой смеси вдоль колонки. Другая часть той же жидкости проникает в поры зёрен геля и выполняет функцию неподвижной фазы [10].

    Разделение смеси веществ происходит в том случае, если размеры молекул этих веществ различны,  а диаметр пор зёрен геля постоянен и может пропускать лишь те молекулы, размеры которых меньше диаметра отверстий пор геля. При фильтровании раствора анализируемой смеси более мелкие молекулы, проникая в поры геля задерживаются в растворителе, содержащемся в этих порах, и движутся вдоль слоя геля медленнее, чем крупные молекулы, не способные проникнуть в поры. Таким образом, гель хроматография позволяет разделить смесь веществ в зависимости от размеров и молекулярной массы частиц этих веществ. Этот метод разделения достаточно прост, быстр и, что самое главное, он позволяет разделять смеси веществ в более мягких условиях, чем другие хроматографические методы.

    В реальных условиях, кроме основного фактора, обуславливающего разделение, могут играть роль и другие факторы, в частности  адсорбция, химическое взаимодействие и др. Однако выбор условий хроматографирования позволяет свести действие побочных факторов к минимуму.

    Если гранулами геля заполнить колонку и затем налить в нее раствор различных веществ с разной молекулярной массой, то при движении раствора вдоль слоя гелия в колонке будет происходить разделение этой смеси (рисунок 2).

    На рисунке 2 (а), изображён начальный период опыта: нанесение раствора анализируемой смеси на слой гелия в колонке. На рисунке 2 (б) , приведён второй этап – гель не препятствует диффузии молекул малого размера в поры, крупные же молекулы остаются в растворе, окружающем гранулы гелия. При промывании слоя гелия чистым растворителем крупные молекулы начинают двигаться со скоростью, близкой скорости перемещения растворителя, в то время как мелкие молекулы должны сначала продиффундировать из внутренних пор геля в объём между зёрнами  и вследствие этого задерживаются (рисунок.2 в).