Гель хроматография

Однако более широко применяемым и, по-видимому, наиболее точным методом является элюирование отдельных соединений с последующим колориметрированием или определением поглощения в ультрафиолетовой области. При работе с радиоактивными веществами можно производить измерение общей или удельной активности элюируемого вещества[17].

Точность методов количественного хроматографического анализа равна 10%.

1.2.4 Газожидкостная хроматография триметилсилильных производных сахаров

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) триметилсилиловых эфиров (ТМС) производных углеводов представляет собой хорошо отработанный метод, который в течение ряда лет используется для анализа сложных смесей сахаров, таких, как кукурузная патока или в общем случае гидролизаты полисахаридов. С совершенствованием методов силилирования создавалась новая хроматографическая аппаратура и изыскивались новые жидкие фазы. Все это позволило не только улучшить разделение сложных смесей сахаров, но и расширить область применения ГЖХ вплоть до разделения гептасахаридов. Бробст и Лотт разработали метод, позволяющий проводить анализ образцов, содержащих небольшие количества воды, и, используя его, смогли определить олигосахаридный состав кукурузной патоки вплоть до тетрасахаридов. Позднее в качестве силилирующего агента стал использоваться N-(триметилсилил) имидазол и смесь его с пиридином, ставшая коммерческим реактивом. Показано, что данный реактив обладает хорошими растворяющими свойствами и может использоваться для силилирования влажных образцов сахаров.

Этот метод не только допускает наличие в образце до 40 мг воды, но и существенно увеличивает устойчивость триметилсилиловых эфиров, так как в смеси присутствует большой избыток реагента. Поэтому стандартная калибровочная смесь устойчива в течение нескольких месяцев, что весьма важно для хранения контрольных образцов редких олигосахаридов.

1.2.5 Газожидкостная хроматография метиллированых сахаров

Газожидкостная хроматография представляет собой надежный и широко распространенный метод качественного и количественного анализа сахаров. Разделение методом ГЖХ метиловых эфиров сахаров и их производных приобрело особенно большое значение при исследовании структуры олиго- и полисахаридов. Восстанавливающие метилированные сахара нельзя изучать методом ГЖХ в первую очередь потому, что они прочно сорбируются на неподвижной фазе или носителе, и их, как правило, переводят в метилгликозиды. Последние либо непосредственно анализируют на газовом хроматографе, либо, если время удерживания метилгликозидов слишком велико, предварительно ацетилируют или силилируют.

Иногда разрешающая способность колонки недостаточна для разделения аномеров пиранозных и фуранозных форм некоторых метилированных гликозидов или их производных. В таком случае метилированные сахара анализируют в виде ацетатов или триметилсилиловых эфиров альдитов.

Как было установлено, детекторы дают различный отклик на различные метилированные сахара, содержащиеся в одинаковых концентрациях. Однако пока не известно, является ли это следствием особенностей, присущих детекторам, или следствием потерь некоторых компонентов при подготовке образца к анализу и преимущественной сорбции их на колонке. Твердые правила выбора колонки еще не выработаны. Тем не менее изучение литературных данных показывает, что большинство исследователей предпочитают полярные фазы, которые, по-видимому, дают лучшее разрешение всех типов производных метилированных сахаров. Обычно время удерживания соединения выражают по отношению ко времени удерживания стандарта. Это позволяет избежать расхождений, наблюдаемых для абсолютных значений времени удерживания и обусловленных нестандартностью условий анализа. Результаты определения относительного времени удерживания на одной и той же колонке воспроизводятся с точностью до ±2 %, а на разных колонках с одинаковыми неподвижными фазами - с точностью до ±5 %.

Время удерживания многих производных углеводов достаточно велико, что приводит к плохому разделению смесей, обусловливает низкую концентрацию элюируемых компонентов в газе-носителе, и в итоге приводит к увеличению ошибки при определении содержания компонентов в смесях. Поэтому при проведении разделения метилированных сахаров желательно подбирать такие производные и такие условия работы, при которых все компоненты смеси элюировались бы с колонки в течение 70—90 мин с момента их введения. Если детектирование не сопровождается разрушением сахаров, их можно собирать на выходе с хроматографа [18].

2 Экспериментальная часть

В экспериментальной части проводилась разработка метода разделения и анализа смеси моно-, ди-, полисахаридов.

В качестве объекта исследования были выбраны сахариды: сахароза, мальтоза, лактоза, манит, рамноза, дульцит, инозит, арабиноза, глюкоза, фруктоза, инулин .                      

Для исследования использовалась хроматографическая колонка длиной 50 см3, диаметром 15 см.

Для непосредственного измерения показателя преломления  использовался рефрактометр ИРФ-470. Принцип действия рефрактометра основан на явлении полного внутреннего отражения при прохождении светом границы раздела двух сред с разными показателями преломления.  Показатель преломления прозрачных сред определяют в проходящем свете. Несколько капель исследуемой жидкости помещают между двумя гипотенузными гранями АВ измерительной призмы 1 и А1В1  осветительной призмы 3 (рисунок 8).

Рисунок 8 - Схема призм рефрактометра

Лучи света проходят осветительную призму 3, рассеиваясь на выходе матовой гранью А1В1, входят в исследуемую жидкость и попадают на полированную грань АВ. Поскольку на рефрактометре исследуются вещества, показатель преломления которых меньше показателя преломления измерительной призмы, то лучи всех направлений, преломившись на границе жидкости и света войдут в призму 1. При этом коэффициент преломления искомой жидкости определяется следующим выражением:

,

где - показатель преломления измерительной призмы, - угол выхода луча из измерительной призмы, - преломляющий угол измерительной призмы.

При рассмотрении пучка лучей в измерительной части рефрактометра в зрительную трубу верхняя часть поля последней останется темной, а нижняя часть будет освещена. Получаемая граница светотени определяется лучом, выходящим из призмы 1 под предельным углом и с помощью специальной оптической схемы проектируется в зрительный окуляр.

Перед началом работы на рефрактометре необходимо проверить правильность установки шкалы показателя преломления на начальный отсчет по эталонному образцу. Рефрактометр и источник света  устанавливают так, чтобы свет падал на входное окно осветительной призмы. Затем нужно откинуть осветительную призму и очистить полированное стекло измерительной призмы с помощью спирта-ректификата и резиновой груши. На очищенную таким образом поверхность осторожно, не касаясь призмы, капилляром нанести две-три капли жидкости. Опустить призму и прижать ее специальным крючком. Измерения проводить в проходящем свете. Жидкость должна равномерно распределиться по всей поверхности, но не выступать по краям.

Наблюдая в окуляр за полем зрения, установить резкое по глазу изображение шкалы.

Поворотом кольца устранить окрашенность границы светотени. Добиться наиболее качественного изображения границы светотени изменением положения рефрактометра относительно источника света.

Затем установить на соответствующей шкале табличный показатель преломления эталонной жидкости [19].

Процессы сорбции, осаждения, ионного обмена, распределения между фазами различного состава протекают непрерывно, при последовательном многократном повторении. Такой процесс осуществляется в хроматографической колонке. Анализируемая смесь в виде раствора (жидкая фаза) фильтруется через колонку, содержащую слой сорбента (твёрдая фаза)[20].

1-стеклянная трубка, 2- тампон стеклянной ваты, 3-сорбент, 4- анализируемый раствор

Рисунок 9 - Хроматографическая колонка

Для подготовка хроматографической колонки в мерный цилиндр вместимостью 500 см3 помещают 5 г сухого сефадекса, заливают водой до метки и оставляют для набухания на сутки. Затем содержимое цилиндра перемешивают до получения однородной системы. Перед заполнением колонки воздух из набухшего сефадекса удаляют перемешиванием. В нижнюю узкую часть колонки помещают тампон из стекловаты, служащий опорой  для носителя. После  заполнения колонки гелем на требуемую высоту (15 см) продолжают пропускать воду, оставшеюся в колонке, так чтобы над поверхностью сефадекса образовался слой жидкости высотой 1 см, не допускать проскока жидкости ниже уровня сефадекса.

Для пробоподготовки использовались анализируемые растворы концентрацией 1 моль/дм3.

Выполнение анализа проводилось в следующей последовательности: жидкость в колонке опускают до уровня сефадекса. Анализируемый раствор (1 см3) осторожно, в один приём, по стенке колонки вводят в верхнюю часть колонки, стараясь не взмутить верхний слой сефадекса. Одновременно под край колонки помещают мерный цилиндр вместимостью 25 см3 и открывают кран. После впитывания раствора в верхний слой сефадекса добавляют промывной жидкости (раствор дистиллированной воды с хлороформом). Включаем секундомер, каждую третью каплю отбираем и смотрим показатель преломления на рефрактометре, при этом отмечаем время отбора капли. Анализ продолжаем до тех пор пока показатель преломления возрастёт, а затем понизится до первоначального значения. Полученные данные представлены в таблицах 2-15.

Таблица 2- Результаты определения показателя преломления  сахарозы

Время удерживания (τ)- 41мин 32 с, V=11 см3.

Таблица 3- Результаты определения показателя преломления  дульцита