Гель хроматография

а- момент ввода смеси;

б-последующее распределение смеси-мелкие молекулы начинают диффундировать в поры геля;

в-состояние после промывания-крупные молекулы остаются между гранулами геля и вымываются.

Рисунок 2 - Схема разделения смеси двух веществ разной молекулярной массы в гель-хроматографии

    Происходит разделение смеси веществ согласно их молекулярной массе. Вымывание веществ из колонки происходит в порядке уменьшения их молекулярной массы.

    Однако разделение смеси веществ методом гельхроматограффии возможно и в том случае, когда молекулы компонентов разделяемой смеси обладают небольшим различием и, следовательно, в молекулярных массах. Тогда следует подбирать гель с такими размерами пор, чтобы они были доступны для всех веществ смеси. Очевидно, что при прочих условиях разделение в этом случае становится более полн6ым при достаточно больших длинах колонок. Можно использовать гели, поры которых не доступны молекулам лишь одного вещества, а для остальных веществ они проницаемы, но в разной степени.

    Наконец, применение гель – хроматографии возможно и в том случае, когда все вещества анализируемой смеси обладают одинаковой молекулярной массой, Тогда в основе разделения лежит различие во взаимодействии анализируемых веществ с фазой геля. Обычно рассматривают два вида взаимодействия: кулоновское между заряженными молекулами разделяемой смеси и ионогенными группами в скелете гелия и взаимодействие, связанное с дисперсионными силами взаимодействия между растворенными веществами и фазой набухшего геля. Этот вариант гель – хроматографии широко применяется для разделения смеси веществ низкой молекулярной массы.

    Интересно также применения гель – хроматографии для определения распределения веществ по молекулярным массам полидисперсных системах.

   Метод гель – хроматографии выполняется в двух вариантах: колоночном и в тонком слое.

   Для правильного понимания процесса,  происходящего в колонке, заполненной гелем и раствором, целесообразно рассмотреть объёмные соотношения в слое геля. Объём колонки заполнен зёрнами геля, растворителем, находящимся в порах геля и, следовательно, «связанным» с гелем, и растворителем, занимающим пространство между зёрнами геля и свободно протекающим вдоль слоя. Таким образом, общий объём столбика геля Vt в колонке определяется суммой трёх объёмов : внешнего объёма Vвн т.е. объёма между зёрнами, объёма внутри пор Vпор и объёма зёрен сухого геля, матрицы Vмт

Vt=Vвн+Vпор+Vмт, (1).

    Общий объём Vt равен объёму колонки. Внешний объём Vвн можно определить, если хроматографировать на колонке, заполненной гелем, какое либо высокмолекулярное вещесто, не способное проникать в поры геля : объём растворителя, прошедшего через слой геля до проскока хроматографируемого вещества, соответствует внешнему объёму. Внутренний объём Vпор связан с пористостью геля. Для ксерогелей, т.е. Для слабо набухающих гелей, Vпор определяется сравнительно просто. Для этого следует знать величину Sг, называемою ёмкостью геля по растворителю и равную количеству растворителя в граммах, поглощённого при набухании 1 г сухого геля. Для определения ёмкости по растворителю навеску сухого геля оставляют набухать в выбранном растворителе, затем последний удаляют осторожным продолжительным центруфугированием, после чего набухший гель взвешивают. Разность масс набухшего и сухого гелей, отнесённая к единице массы сухого геля, и составляет значение Sг. Отсюда

Vпор=gSг/ρ, (2)

где g- масса сухого геля; ρ-плотность растворителя.

   Для вычисления объёма матрицы Vмт необходимы данные об удельном объёме сухого полимера, образующего гель, что не всегда можно узнать. Поэтому Vмт можно заменить плотностью геля ρг (ρг определяют пикнометром) в набухшем состоянии и вычислить Vпор по уравнению, вытекающему из уравнения (1):

Vпор=Sгρг(Vt-Vвн)/(Sг/ρг1), (3).

   Для сильно набухающих гелей  значением Vмт можно пренебречь.

    На рисунке 3  изображена обычная проявительная хроматограмма трёх веществ, полученная при помощи гель-хроматографии.

Рисунок 3 -  Хроматограмма смеси крахмала (К) и глюкозы (Г)

на сефадексе

Пунктиром нанесён пик произвольно выбранного вещества с промежуточной молекулярной массой: Vвн-внешний объём; Vпор-внутренний объём; Vt- общий объём; Vвых-ообхём выхода; Vs-объём разделения.

     Здесь введена ещё одна величина: объём выхода Vвых, равный объёму растворителя, прошедшего весь слой геля от момента внесения анализируемого вещества в колонку до появления максимума концентрации этого вещества на выходе. Нетрудно видеть, что Vвых является обычным удерживаемым объёмом. Для молекул, не проникающих в гель, Vвых=Vвн.

    Объём выхода зависит только от размеров молекул веществ разделяемой смеси. Как показывает опыт, он не зависит ни от скорости вымывания веществ, ни от концентрации вымываемых соединений, ни от температуры колонки. На основании большинства опытов установлено, что объём выхода прямо пропорционален логарифму молекулярной массы.

    Разделение смеси веществ в гель хроматографии будет достаточно полным, если компоненты смеси обладают разными размерами молекул. В этом случае для части молекул внутренний объём пор окажется доступным лишь частично, для других же молекул он может оказаться полностью недоступным. Поэтому для определения возможности разделения той или иной смеси Лорент и Килландер ввели коэффициент, характеризующий степень доступности молекул: К=Vвых-Vвн/Vt-Vвн, не зависящий от геометрии и плотности заполнения колонки, а лишь от свойств системы. Этот коэффициент может служить характеристикой свойств системы сорбат-сорбент. Пользуясь величиной К, которую кстати, нетрудно определить экспериментально, можно вычислить объём разделения Vs ( рисунок 2), характеризующий степень разделения смеси двух веществ:

Vs=Vיвых-Vייвых=(Кי-Кיי)(Vt-Vвн), (4)

(штрихами обозначены величины, относящиеся к двум соседним веществам на хроматограмме).

Как и в других рассмотренных выше видах хроматографического разделения, на эффективность процесса в гель-хроматографии оказывает влияние размывание зоны вещества. Существенным отличием гель-хроматографии, однако, является то обстоятельство, что в процессе участвует весьма незначительная доля объёма геля, вследствие чего продвижение вещества по слою слабо тормозится взаимодействием его с гелем. Таким образом, этот фактор оказывает положительное действие на повышение эффективности колонки.

    Вторым фактором, оказывающим влияние на размывание, является медленность установления диффузионного равновесия. Для уменьшения действия этого фактора следует работать с мелкими частицами геля и при малых скоростях потока подвижной фазы. Кроме того, вследствие зависимости коэффициента диффузии от размеров молекул при прочих равных условиях зависит от природы разделяемых веществ и возрастает с ростом их молекулярной массы. Диффузия в продольном направлении возрастает с уменьшением молекулярной массы и, следовательно, для низкомолекулярных веществ и при малых скоростях потока действие продольной диффузии на размывание может оказаться значительным.

   Таким образом, наиболее важными факторами, оказывающими влияние на размывание, являются медленность достижения диффузионного равновесия и продольная диффузия.

   Для хотя бы элементарного описания механизма взаимодействия молекул растворённого вещества с гелем можно представить себе доступный для молекул внутренний объём геля в виде конуса и положить, что молекулы растворённого вещества обладают сферической формой. Таким образом, внутренний объём геля по- разному доступен для молекул различного размера, а уравнение(1) преобразуется в

Vвых=Vвн+KdVпор, (5)

где Кd=(Vвых-Vвн)/Vпор. При прочих равных условиях Кd зависит лишь от   размеров молекул и , следовательно, может служить характеристикой поведения вещества в колонке.

   Если объём рассматриваемого конуса равен Vпор, то рабочая часть его объёма, т.е. объём, доступный для данного сорта молекул, равен Кd. Тогда

Кd=к(1-(2rм/Rк)3, (6)

где Rк-радиус конуса; к-константа.

    Объём всего конуса пропорционален степени набухания (R=кSг) и для гибких макромолекул с равными сегментами определяется как M=kr2 м, где М-молекулярная масса. Тогда уравнение (6) преобразуется в

Kd=k1(1-k2(M1/2/Sг1/3)3, (7).

   Для конкретного геля уравнение (7) принимает более простую форму:

kd1/3=const – const M1/2, (8).

   Этот вывод проверен на большом числе экспериментальных данных и поэтому может служить методом определения молекулярной массы.

Допущения предложенные Поратом относительно геометрической формы доступных областей геля, произвольны. Однако они удобны, так как достаточно наглядно объясняют связь между размерами частиц хроматографируемых веществ и параметрами их вымывания из колонки. Заметим, что выведенные уравнения, несмотря на сделанные допущения, достаточно удовлетворительно согласуются с экспериментом. Изложенный Поратом принцип требует выполнение уравнения(8). В этом случае требуется, чтобы значение эффективных радиусов совпадали с величинами, вычисленными по уравнению (8) путём подстановки в него значений Kd. Многочисленные экспериментальные данные дают, как правило, хорошие совпадения.

    Для определения молекулярных масс используют тот факт, что зависимость между логарифмом удерживаемого объёма и логорифмом молекулярной массы в некотором диапазоне является линейной. Принцип определения молекулярной массы по значениям проиллюстрирован на рисунках 4,5  [11].

Рисунок 4 - Биологарифмическая зависимость между удерживаемыми объёмами и относительными молекулярными массами стандартных веществ

Рисунок 5  - Определение молекулярных масс неизвестных веществ.

В  хроматографической практике применяют довольно широкий ассортимент различных по природе и свойствам гелей. Поэтому для правильного их выбора следует придерживаться определённой классификации.

Не подвижные фазы в эксклюзионной хроматографии выбирают для решения конкретной аналитической задачи. Первоначально устанавливают, какая система растворителей может быть использована для анализа (водная или водноорганическая), что и определяет тип сорбента. Так, например, разделение водных смесей проводят на сшитых декстранах (сефадекс) или полиакриламиде (биогель Р). С органическими растворителями разделение поводят на гидрофобных полистиролах с различной степенью сшивки (стирогель, порагель, биобид С). Подобные гидрофобные гели обладают хорошей разделяющей способностью только в том случае, если полимер набухает в органическом растворителе. Такие набухшие гели неустойчивы к давлению, скорость потока очень низка. Для эксклюзионной хроматографии при высоких давлениях колонки заполняют устойчивыми к давлению неподвижными фазами с жёсткими матрицами- силикагелями [12].

   Принято подразделять гели на мягкие, полужёсткие и жёсткие. Каждые из них могут быть гидрофильными и гидрофобными. Такая классификация очень удобна, так как она позволяет правильно выбрать гель с точки зрения его разрешающей способности, так и соответствия выбранном растворителю.

   Мягкие гели являются органическими высокомолекулярными соединениями, обладающими незначительным числом поперечных связей. Они способны поглощать большое количество растворителя, набухая и увеличивая при этом собственный объём. Их пористость возрастает пропорционально объёму поглощенного растворителя. Как следствие этого ёмкость мягких гелей снижается, а сам гель подвергается деформации. Поэтому мягкие гели, как правило, применяются для разделения смесей низкомолекулярных веществ и при малых скоростях потока. Более широкое применение они нашли в тонкослойной хроматографии.

   К гидрофильным мягким гелям относятся сефадексы, или декстрановые гели, имеющие мостики типа –О-СН2СН(ОН)СН2-О- , агарозные гели, обладающие водородными мостиками, связывающими цепи агарозы, полиакриламидные гели и крахмал.

   Для работы с органическими растворителями применяют липофильный сефадекс, получаемый введение в матрицу гидрофильного сефадекса оксипропиловых групп, и поперечносшитые агарозные гели.

  Мягкие гели обладают высокой эффективностью. Фактор ёмкости для них, т.е. отношение объёма растворителя внутри геля V1 к объёму вне геля V2, равен трем.

    Процесс хроматографирования на мягких гелях принято называть гель-фильтрацией.

   Полужёсткие гели  получают полимеризацией. Они обеспечивают достаточно высокую проницаемость и среднюю ёмкость, мало зависящую от размера пор. В отличие от мягких гелей полужёсткие гели увеличивают свой объём при набухании незначительно: в 1,1-1,8 раза. Фактор ёмкости для них лежит  в пределах 0,8-1,2. Полужёсткие гели хорошо противостоят высоким давлениям и не подвергаются деформации.

   Как правило, полужёсткие гели гидрофобны. Гидрофильность достигается лишь химической или физической обработкой, например мягким сульфированием.

   Наибольшее распространение получили гели - продукты сополимеризации стирола и дивинилбензола с большим числом поперечных связей. Этого типа гели известны под названием стирогелей. К полужёстким гелям также относится поливинилацетатный гель, получаемый сополимеризацией винилацетата и бутандиол-1, 4-дивинилового эфира. Процесс хроматографирования на полужёстких гелях известен как гель проникающая хроматография.

   К жестким гелям обычно относят не только силикагели, но и пористые стёкла, хотя последние не являются гелями. Жёсткие гели обладают фиксированным размером пор, не изменяющимся ни при каких условиях, что обеспечивают высокую проницаемость колонок. Фактор ёмкости этого типа гелей невелик – 0,8-1,1. Жёсткие гели могут быть как гидрофильными, так и липофильными. Недостатком жёстких гелей является наличие адсорбционных свойств  вследствие того, что силикаты, как правило, содержат  гидроксильные группы. В некоторых случаях адсорбционное сродство удаётся уменьшить или свести на нет химической обработкой гелей. Вторым недостатком является большее размывание, чем в мягких и полужёстких гелях. Это объясняется увеличением сопротивления массопереносу в образующихся застойных зонах подвижной фазы.