Гель хроматография

    В качестве жёстких гелей обычно применяются пористый силикагель (порасил), пористые стёкла с контролируемым размером пор и аэросилогели- синтетические макропористые кремнеземы с жёсткой пористой структурой и однородным размером пор. Аэросилогели отличаются высокой степенью химической чистоты и отсутствием каталитического воздействия на хроматографируемые вещества.

    Большое значение имеют сорбенты на основе пористого стекла с привитыми углеводами. Они сочетают гидрофильный характер поверхности с высокой механической прочностью и предназначаются для разделения методом гель - хроматографии смесей высокомолекулярных соединений в водных растворах.

   При выборе растворителя, главное требование к растворителям, применяемым в гель-хроматографии, заключается в способности его растворять все исследуемые соединения смеси, смачивать поверхность его зёрен. При анализе поливиниловых спиртов в качестве подвижной фазы часто используют тетрагидрофуран, при анализе полиэлектролитов- воду .

   Для мягких гелей растворитель должен способствовать их набуханию. В идеальном случае растворитель, заполняющий поры геля и пространство между зёрнами геля, должен одинаково взаимодействовать с молекулами хроматографируемых веществ. Тогда перемещение растворённых веществ в поры происходит только за счёт диффузии.

    Не маловажное значение имеет вязкость растворителя, с которой связана скорость массообмена. Особенно низкой должна быть вязкость растворителя для растворов высокомолекулярных соединений, обладающих малым значением коэффициента диффузии.

    Выбор растворителя в гель-хроматографии зависит также от применяемой системы детектирования. Если детектором служит дифференциальный рефрактометр, целесообразно в качестве растворителей применять толуол, трихлорбензол, м-крезол, т.е. вещества с высоким показателем преломления. При использовании ультрафиолетового детектора эти растворители непригодны, их заменяют хлороформом или четырёххлористым углеродом.

    Роль солей, присутствующих в анализируемом растворе, также приходится учитывать, так как некоторые полимерные вещества могут изменять размеры своих молекул при наличии в растворе электролитов. Кроме того, электролит может оказывать влияние на набухаемость мягких гелей и изменять размеры их пор.

    Наиболее часто применяемыми в гель-хроматографии растворителями наряду с водой являются N,N′-диметилформамид, хлороформ, четырёххлористый углерод, 1,1,2,2-тетрахлорэтан, толуол, 1,2,4-трихлорбензол, м-крезол, тетрагидрофуран и др. [13].

Для детектирования могут использоваться детекторы различных типов, применяемые в жидкостной хроматографии - рефрактометрические, фотометрические (в УФ- или ИК-области) и др., сигнал которых пропорционален концентрации растворённого вещества.

   Специфическим типом детекторов для анализа высокомолекулярных соединений являются вискозиметры. Они измеряют вязкость протекающего через них элюента. В присутствии высокомолекулярных веществ вязкость раствора возрастает, что регистрируется на хроматограмме в форме пика .

    В гель хроматографии все возможные значения удерживаемых объёмов укладываются в точно определённый интервал между V0 и V0+Vр, где V0 –мёртвый объём колонки ,(объём межзёрного пространства), Vр –суммарный объём пор. Поэтому данный метод характеризуется небольшими временами удерживания, определяемыми значениями коэффициента распределения К. Пики на гель - хроматограммах обычно достаточно узкие и хорошо воспроизводимые. Ввиду, того что вещество не претерпевает в ходе хроматографического процесса никаких химических взаимодействий, она выходит из колонки  в неизменном виде и без потерь. Поэтому гель-хроматографию можно использовать и в препаративных целях. С другой стороны, и вещество не оказывает никакого взаимодействия на колонку, что нередко наблюдается в других видах хроматографии[14].

1.2.2 Распределительная хроматография на ионообменных смолах

Впервые разделение углеводов методом распределительной хроматографии на ионообменных смолах в смесях растворителей различной полярности было описано в 1952 г. В последние годы метод был значительно усовершенствован. В качестве элюента при разделении сахаров и их производных наиболее пригоден водный спирт, и далее речь будет идти только об этом элюенте.

Одним из основных факторов, обусловливающих сорбцию сахаров точно так же, как и других полярных неэлектролитов в данном виде хроматографии, является неодинаковое распределение компонентов элюирующей смеси между смолой и внешним раствором. В случае водного спирта относительное количество воды в неподвижной фазе выше, чем в подвижной, и этим объясняется тот факт, что смолой преимущественно удерживаются полярные вещества. На состав подвижной и неподвижной фаз существенное влияние оказывает также взаимодействие смола - растворитель и смола - растворенное вещество. При смене противоиона порядок элюирования некоторых сахаров может измениться.

Коэффициенты распределения веществ возрастают с увеличением концентрации спирта и уменьшаются с повышением температуры. За редким исключением, коэффициенты распределения растут с увеличением числа гидроксильных групп в молекуле. Введение в молекулу неполярных групп, например метильных, приводит к уменьшению коэффициента распределения. Величина последнего зависит также от положения заместителей.

В таблице 1 приведены коэффициенты распределения ряда свободных сахаров.

Распределительная хроматография на ионообменных смолах была с успехом применена для разделения моно- и олигосахаридов, альдитов и производных сахаров, не содержащих ионогенных группировок, например гликозидов и частично метилированных сахаров. Этот метод можно использовать как в аналитических, так и в препаративных целях.

Таблица 1 - Коэффициенты объемного распределения (Dv) некоторых моносахаридов и ангидросахаров при различных температурах и концентрациях спирта

На рисунке 6 приведена принципиальная схема прибора, используемого для разделения сахаров. Элюент (спирт — вода) помещают в колбу Мариотта и обезгаживают кипячением, чтобы предотвратить появление пузырьков воздуха в колонке. За колбой расположена открытая градуированная трубка, обычно заполненная элюентом. Скорость движения элюента в системе регулируют, перекрывая выходное отверстие колбы. Элюент подается в колонку поршневым насосом из нержавеющей стали который помещают ниже остальных аппаратов системы элюирования..

Рисунок 6 - Аппаратура для проведения хроматографического разделения и автоматического анализа сахаров

Давление измеряют манометром Бурдона, снабжённым прерывателем. Последний отключает насос и нагреватель, если давление в системе превышает норму (80 атм) и также если оно падает из-за утечки жидкости. Анализ можно проводить на колонках, имеющих пористое дно и тефлоновое уплотнение на верхнем конце колонки. Если работа ведется при высоком давлении, не рекомендуется пользоваться колонками со стеклянными фланцами. Вместо них можно использовать стеклянные трубки с приклеенными эпоксидной смолой муфтами из поливинилхлорида [15].

Чтобы в колонке поддерживалась требуемая температура (70-90 °С), по рубашке колонки циркулирует вода из термостата. Повышение температуры колонки приводит к сужению зон вымываемых веществ и снижению рабочего давления.

Смолы, применяемые в распределительной хроматографии, представляют собой сильноосновные аниониты или сильнокислые катиониты, основу которых составляет сополимер стирола и дивинилбензол. В аналитических колонках, диаметр которых равен 2—6 мм, а скорости элюирования высокие, рекомендуется использовать мелкозернистые смолы с размером частиц 8—13 или 10—15 мкм. Для препаративнго разделения сахаров на широких колонках (диаметр 12—25 мм) и при меньшей скорости элюирования можно применять более грубые смолы.

Колонку промывают элюентом до тех пор, пока не образуется однородный слой ионита. После этого растворитель, находящийся над слоем смолы, отсасывают, в колонку переносят новую порцию суспензии и операцию повторяют. Перед хроматографическим разделением заполненную колонку приводят в состояние равновесия с элюентом данного состава, промывая ее элюентом не менее 16 ч.

Анализирующая система. Определение сахаров и их различных производных в элюате удобно проводить автоматически орциновым методом. Раствор реагентов хранят в бутыли из темного стекла, откуда он и подается в систему при помощи поршневого насоса. Между насосом и тройником, в котором происходит смешение элюата с раствором красителя, расположено устройство для гашения (демпфирования) пульсаций давления (рисунок 1). Смесь элюата с раствором красителя пропускают через змеевик длиной 20 м и диаметром 1,2 мм, погруженный в термостатируемую полигликолевую баню (100°С). Время нахождения смеси в змеевике около 10 мин. Интенсивность окраски раствора определяется спектрофотометрически при 420 нм проточных кюветах с l 2—15 мм. Удобно пользоваться системой из двух последовательно соединенных кювет разной длины: если на более длинной кювете самописец «зашкаливает», измерения проводят на более короткой кювете. На колонке диаметром 4 мм удается разделить и проанализировать от 2 до 20 мкг веществ. На колонках меньшего или большего диаметра можно проанализировать соответственно меньшее или большее количество смеси.

Достоинством вышеописанной схемы анализа является высокая точность количественного определения и отсутствие необходимости в частом построении калибровочных кривых (при постоянстве условий анализа). Если удается достичь полного разделения компонентов, отклонение от среднего значения в двух аналогичных анализах составляет менее 1%. Однако весь элюат расходуется за одно определение, и потому не удается провести дополнительное исследование фракций.

Если проводится препаративное разделение или если проводимые исследования требуют повторного разделения и дополнительных анализов компонентов смеси, то для разделения потока элюата и введения растворов реагентов следует использовать перистальтический насос. Такая схема анализа (рисунок 6) отличается большей гибкостью, однако недостатком ее является более низкая точность количественных определений в связи с тем, что соединительные трубки насоса быстро изнашиваются и их приходится менять через 14 дней.

М- сместители; Р1 и Р2 – гасители пульсации; L – флуоресцентная лампа трубки; А – орционный канал: 16-ти % водный раствор орциона, 60% серная кислота; В – периодат-формальгидный канал

Рисунок 7 - Двухканальный анализатор для одновременного определения восстанавливающих сахаров и альдитов

На рисунке 7 приведена схема анализа с применением перистальтического насоса. Элюат делится на три потока и одновременно анализируется орциновым (А) и периодат-формальдегидным (В) методами. Третий поток подается на коллектор фракций или отбрасывается. В элюате дополнительно определяют содержание восстанавливающих сахаров периодатным или феррицианидным методом. Выделенные ациклические альдиты анализируются автоматически периодат-формальдегидным методом. В кислой среде они окисляются периодатом с образованием формальдегида, который определяют до реакции с пентандионом-2,4 в растворе ацетата аммония. Избыток периодата предварительно восстанавливают арсенитом. В условиях анализа при окислении большинства альдитов образуется с высоким выходом формальдегид, в то время как при окислении большей части альдоз формальдегид образуется лишь в незначительных, с трудом детектируемых количествах. Исключение составляет D-фруктоза, ее можно достаточно точно определить этим методом. Периодат-формальдегидегидный метод в совокупности с орциновым используется для анализа сложных смесей сахаров и альдитов. Точность его сравнима с точностью орцинового метода [16].

1.2.3 Хроматография на бумаге

В последнее время хроматографию на бумаге все чаще начинают использовать в качестве самостоятельного количественного метода. При этом весьма широкое распространение получает количественная хроматография углеводов: моно-, ди- и олигосахаридов, а также продуктов гидролиза крахмала, целлюлозы и других полимеров. Количественное определение индивидуальных веществ, разделяемых на хроматограммах, производится различными способами. Существует ряд методов, при помощи которых можно определить концентрацию разделенных веществ непосредственно на бумаге. Это методы: визуальное сравнение (полуколичественный), измерение площади пятен, измерение интенсивности окраски пятен, определение максимальной плотности окраски пятен. В случае работы с радиоактивными веществами можно легко установить активность этих соединений при помощи счетчика Гейгера — Мюллера.