Зертханалық диагностиканың ролі және зерттеу объектілері

Миллиметрлік   кагаз бетіне калибровтік графикті. яғни заттың оптикалық тығыздығының оның концентрациясына тәуелділігін сипаттайтын D=f(C)  графигін салу керек, ол үшін ордината өсіне оптикалық тығыздықтың, ал абцисса осіне концентрациянын мәнін салыңыз.

3.4. Концентрациясы белгісіз ертіндінің  концентрациясын анықтау

Ерітіидідегі заттың белгісіз концентрациясын (Сх) анықтау үшін бұл ерітіндіні кюветаға кұйып, оның оптикалык тығыздығын (1)х) анықтау керек. Содан кейін калибровтік графиктен оитикалық тығыздықтың мәніне сәйкес келетін нүктені тауып, сол нұкте арқылы (С) осіне параллель, графикпен қиылысқанша түзу жүргіз. Қиылысу нұктесінен (С) осіме нерпендикуляр түсіріп Сх-тің мәнін анықтаймыз.

3.5 Студенітің өз бетінше дайындауына арналгап сұрактар

1. Жарықтың жұтылуы.

2. Бугер-Ламберт заңы.
3. Бугер-Ламберт-Бер біріккен заңы.
4. Өткізу және жұтылу коэффициенті.
5. Ертіндінің оптикалык тығыздығы.
6. Фотоэлектрокалориметрдегі жарық жолы.
7. Жұтылу көрсеткішінің толқын ұзындыгы мен  дене  күйіне байланыстылығы.
8. Жарық фильтрі мен ертінді түсінің арасындағы байланыс.

 

Аминқышқылдарды бөлудің хроматографиялық әдісі.

Хроматография –биологиялық зерттеулерде амин қышқылдарын бөлудің ең бір эффектілі және кең қолданылатын әдіс.

  Ең қарапайым және қолайлы  – қағазда бөлу хромтографиясы.

  Принципі: әдіс екі жартылай араласқан сұйықтықта ерігіштік дәрежесіне байланысты, аминқышқылдардың қағазда әртүрлі қозғалуына негізделген.

Жартылай араласқан сұйықтықтың біреуі  H2O қозғалмайтын фазасы, екінші қозғалғыш фаза, суға қаныққан органикалық еріткіш (мысалы, фенол).

   Еріткіш қозғалысының бағытын байланысты хроматографияның бірнеше түрлері бар: осының ішінде жиі қолданатыны жоғары өрлеуші, төмен түсуші . Жеке аминқышқылдардың орналасуын хроматограмманы өңдеу арқылы табады. Ол үшін кептірілген қағазды нингидрин ертіндісімен өңдейді де, кептіргіш шкафта 100қС – қа қыздырады, яғни қағаздағы аминқышқылдарға сапалық нингидрин реакциясын жүргізеді. Аминқышқылдардың ауысу жылдамдығын берілген аминқышқылдың жүрген жолының еріткіштің жүрген жол бағытына қатынасын көрсететінтаралу  коэффициенті Rf арқылы белгілейді.

 

                Rf= a/b

 

Бұл жерде а- белгілі аминқышқылдар қоспа ертіндісін тамызған жерден (старт сызығы) аминқышқылдың дағының ортасына дейінгі аралық.

b- хроматография анықталғаннан кейінгі еріткіштің старт сызығынан фронтқа дейін жүрген жолы, мм. Әрбір аминқышқылы үшін  Rf-тің өзінің мәні бар, ол мән хроматографиялық қағаздың сортына, еріткіш жүйесіне, температураға, рН ортаға байланысты.

  Анықтау әдісі: Пинцетпен лента тәрізді кесілген қағаздың бір шетінен алып, (қағазды қолмен ұстауға болмайды) жібі бар ине арқылы тесіп, кейін ұзындығы 5-6 см келетін ілмектен байлайды, лента тәрізді қағаздың қарама-қарсы ұшынан 2 см тастап, жай қаламен старт сызығын жүргізеді.

Оның ортасна аминоқышқыл қоспа ерітіндісін тамызатын, диаметрі 3-4 мм дөңгелек сызады. Жатқан шыны пробиркаға лента тәрізді қағазды салып порциямен 0,2 мл аминоқышқыл қоспа ерітіндісін біртіндеп құяды. Тамызып болғаннан кейін, қаламмен сызылып қойған дөңгелектен шығып кетпес үшін, дақты кептіреді.

Құрғақ пробиркаға пипетка көмегімен суға қаныққан, 2 мл фенол құяды (фенолмен жұмыс істегенде, абай болындар, күйік туғызады! Пипетканы ауызбен соруға болмайды)

   Пробирканы штативке қатаң  вертикаль бағанада орналастырады. Абайлап, қағаз лентаны ұстай отырып, оның төменгі ұшын еріткішке 2-3 мм батырады да, ілмекті қатты жабылғантығын арқылы бекітіп, қағазды ілінген күйде қыстырып қояды.

   Штативті пробиркасымен  термостатқа (37-38қС) 1,5 сағатқа қояды.

Кейін лентаны алып, кептіргіш шкфта ілмек арқылы 100-105қС температурада 10 минут іліп қояды.

Хромтограмманы өңдеу үшін лентаны 15 мл нингидрин ерітіндісі құйылған Петри шынысына батырады. Кейін пинцетпен ұстап, ерітіндіге малып болғаннан кейін қайта кептіргіш шкафқа сол температурада 5 минутка қойып қояды.

  Жұмысты дайындау: Хроматограммадағы аминқышқылдың орналасуын белгілеп алып ,приборды жұмыс күйінде суретке салып алу.

Сызғыш көмегімен әрбір аминқышқылы үшін а және в қашықтықтарын өлшеп алып, олардың Р мәнін есептейді. Қорытындыда хроматография әдісімен әртүрлі аминқышқылдарды қағазда бөлу мүмкін екендігін көрсетеді.

   Жұмыстың практикалық маңызы:

   Бос аминқышқылдардың қан  сары суында, зәрде және басқа  сұйық орталарда хроматографиялық  анализі аминқышқылдардың алмасуындағы  тұқым қуалайтын аурулардың диагностикасы үшін және бауыр, бүйрек паталогиясын анықтауға, қантты диабеттің ауырлығын анықтау үшін клиникада қолданылады, сонымен қатар фармацияда, белокты гидролизаттардың және аминқышқылдар қоспасынан препараттардың сапасын  бақылау үшін, ал ғылыми эксперименттерде – тазартылған белок гидролизатынан құрамындағы аминқышқылдарын зерттеулерде қолданады.

6. Бақылау: сұрақтар, тестер, есептер, және т.б.

1. Зертханалық диагностиканың түсініктері – диагноз, прогноз, мониторинг, скрининг.

2.Адам организмінің биологиялық сүйықтықтардың калыпты және патологиялық жағдайындағы негізгі көрсеткіштерінің мөлшері.

3.Химиялық , физико-химиялық (фотометрия, рефрактометрия, поляриметрия, флюориметрия,нефелометрия, хроматография) әдістердің негізінде жатқан принциптері, диагностикалық маңызы.

4.Аммиак, зәр қышқылы т.б. заттардың шығу жолдары.

5.Зат алмасуды реттеуінде витаминдер, гормондар, ферментер маңызы, ролі.

 

2.Тақырып. Ферменттер. Ферменттердің зат алмасуға әсер ету механизмдері. Қан плазмасындағы ферменттерді анықтаудың диагностикалық маңызы.

 Тақырып өзектілігі: Ферменттер универсальды биокатализаторлар болғандықтан тірі организм метаболизмін толық қамтиды. Ферменттердің қатысуымен зат алмасу процесстері жүзеге асырылады. Ферменттік реакциялардағы қандай болмасын жайсыз өзгеріс әртурлі патологияға, дертті өзгеріске әкеліп соғады. Жасушаларда немесе биологиялық сұйықтықтағы (мысалы қан плазмасындадағы) белгілі бір фермент активтілігін анықтау арқылы әртурлі мүшелерде және тканьдерде болып жатқан өзгеріс жөнінде тұжырым жасауға болады.

Сабақтың мақсаты: Студенттер ферменттер жөнінде, олардың жалпы қасиеттері және әсер ету механизмдері, фермент активілігіне қатысты зерттеулер адамның ауруы жағдайын, оның диагностикасын бақылау қажет жөніндегі білімдерін қалыптастырулары тиіс.

 Сабаққа дайындалу  тапсырмалары:

1.Ферменттер. Изоферменттер. Ферменттердің зат  алмасуға әсер ету механизмдері.

2.Ағзаның  арнайы ферменттері, ролі.

3.Туқым қуалаушы энзимопатиялар.

4.Қан плазмасындағы, несептегі ферменттер түрлері.

5. Фермент белсенділігінің адамның науқас кезінде өзгеруі.

6.Ферменттерді сандық және басқа әдістер арқылы зерттеу (анықтау), диагностикалық маңызы.

    Ферменттердің активтілігін сандық мөлшермен анықтау әдісі

Ферменттердің сандық мөлшерін анықтаудың негізі  сәйкес фермент пен субстрат арасында жүретін ферментативтік реакция нәтижесінде субстраттың өзгеріске ұшырауы болып табылады. Ферменттердің сандық мөлшерін ферменттердің әсер етуінің нәтижесінде белгілі бір жағдайда ыдыраған субстраттың сандық мөлшерімен немесе ферменттердің әсерінен түзілген өнімдердің сандық мөлшерімен анықтауға болады.

Райтман және Френкель әдісімен қанның сары суында

 аспартатаминотрансферазаның (АСТ) және аланинаминотрансферазаның (АЛТ)

 активтігін  анықтау.

     Принципі: Әдіс аланинаминотрансфераза (АЛТ)  катализдейтін немесе оксалоацетаттың декарбоксилденуін катализдейтін (АСТ) реакциялардың нәтижесінде түзілетін пирожүзім қышқылын анықтауға негізделген. Түзілген пирожүзім қышқылы 2-4-динитрофенилгидразинмен (ДНФГ) түсті реакция беру арқылы анықталады.

Анықтау әдісі : Ферменттің активтігін анықтау төменгі схема түрінде жүргізіледі.

Реактивтер	Ферменттер
	АЛТ		АСТ
	Пробиркалар
	№1	№2	№3	№4
/ала+α-кетоглутар қышқылы/	0,5мл	1,0мл	-	-
/ала+қымыздық сірке қышқылы/	-	-	0,5мл	1,0мл
5 минут 37о С-та инкубацияланады
2,4 –ДНФГ(0,1%)	-	1,0 мл	-		1,0 мл
Қанның сары суы	0,1мл	0,2мл	0,1мл		0,2мл
37о С-та инкубацияланады                               30 мин      -        60 мин       -
2,4-ДНФГ	0,5мл	-	0,5мл		-
Бөлменің температурасында 20 минутқа қалдыру керек.
0,4 NаОН	5,0мл	10мл	5,0мл		10мл
18-20о С-та 10 минут тұрады.

 

Тәжірибе пробиркалары сәйкес бақылау пробиркаларына қарсы 500-560 нм /жасыл фильтр/ қалыңдығы 1 см кюветада ФЭК арқылы фотометрленеді.

  X/АСТ/= немес Х/АЛТ/=

Х- фермент активтілігі ммоль /сағ*л;

С- пробиркадағы калибрленген қисық бойынша табылған пирожүзім қышқылының    мкмоль мөлшері.

10000- 1 л қан сарысуына қайта  есептеу коэффициенті;

1000- мкмоль-дан ммоль-ға айналдыру  коэффициентi;

2-/30 минуттан/ бір сағатқа қайта  есептеу 

Жұмыстың практикалық маңызы: Қалыпты жағдайда аланинаминотрансфераза /АЛТ/ активтілігі 0,1-0,68 ммоль/сағ*л, ал аспартатаминотрансфераза /АСТ/ 0,1-0,45 ммоль/сағ*л тең. Әр түрлі органдардағы паталогиялық процестерді бiлу үшін АСТ мен АЛТ активтiлiгiн және олардың ара қатынасын анықтау клиникалық практикада кең қолданылады. Жүрек бұлшық етiнде АЛТ активтілігіне қарағанда АСТ активтілігі, ал бауырда керісінше АЛТ активтілігі жоғары. Инфаркт миокард ауруларында қанның сары суында АСТ активтiгi артады және АСТ/АЛТ коэффициентi де жоғарылайды. Бауыр ауруларында /цирроз, гепатитте/ әсiресе АЛТ активтiгi артады, ал АСТ/АЛТ коэффициентi төмендейдi.

Райтман мен Френкель әдiсiмен аспартат және аланинаминотрансфераза активтiгiн анықтау үшiн пирожүзiм қышқылының калибрлi қисығы

         Е

0,50 __

0,40 __

0,30 __

0,20 __

0,10 __ 

   |                       |                       |                      |

0,05   0,01    0,15   0,2  С,  мкмоль

 

Эннор және Розенберг әдiсiмен қанның сары суында креатинфосфокиназаның (КФК) активтiгiн анықтау.

   Принцiпi: Бұл әдiстiң негiзi креатинфосфаттан КФК әсерiнен пайда болған креатиндi анықтау. Ферменттiң активтiлігiн түзiлген креатин мөлшерiне қарай анықтауға болады. Түзiлген креатин диацетил және α-нафтолмен қызғылт-сары түстi комплекс түзедi.

    Анықтау әдiсi: Екi пробиркаға көрсетiлген жүйелiкте келесi реактивтер құйылады.

 

Реактивтер	№ 1Тәжiрибе	№ 2бақылау
Трис-буфер	0,2мл	0,2мл
Дистилденген H2O	0,2мл	0,3мл
0,006 м Креатинфосфат	0,1мл	0,1мл
Қанның сары суы	0,1мл	-
3 минутқа 370С температурада 0,6% АДФ	жылы су                                 0,2 мл	моншасында ұстайды 0,2мл
30 минутқа 370С     5%Ba/OH/2	инкубирлейдi 0,2мл	0,2мл
5%ZnSO4	0,2мл	0,2мл