Правила работы в вирусологической лаборатории

Второй этап — специфический. Одна из его особенностей — проявление характерного ЦПД вируса. При этом некоторые вирусы   (аденовирусы   и   др.)   поражают   ядра   клеток,  другие —

Рис.35. ЦПД вирусов в монослое клеток: а — почки человека; б — HeLa; в — почки теленка (начало образования синтициев и симпластов); г — почки теленка (появление больших "стерильных пятен"); д — диплоидные клетки

а) округление клеток. Они принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жидкости;

б) появление в цитоплазме пораженных клеток мелкой зернистости;

в) увеличение в размерах этой зернистости и появление млутриклеточных включений;

г) очаговые скопления округлившихся клеток в виде гроз-дьсн винограда;

д) образование гигантских многоядерных клеток — симпла-f'i'OB, синцитиев;

е) появление в монослое клеток "стерильных пятен", т.е. участков без клеток;

ж) полное "сползание" клеток со стекла.

При латентной инфекции вирус в клетках размножается, но

не вызывает их видимого разрушения. Клетки остаются жизнеспособными, однако интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется их морфология.

При неопластической трансформации у пораженных клеток (в их 1'ие.Зб. Фокус неопластической   _МОНослое) образуются плотные фо-грансформации, вызванный _ы    трансформации    различной

вирусом Рауса в культуре      _{величины  и}  ф₀р_Мы  белого  цвета куриных фибробластов (рис 36)

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Просмотреть под микроскопом монослой первично-трипсинизированных и перевиваемых клеток в норме (не зараженных вирусом).

2. Отработать методику заражения клеточного монослоя ви-руссодержащим материалом.

3. Изучить формы ЦПД вирусов в клеточном монослое под микроскопом, на таблицах и слайдах.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация методики заражения культур клеток; основных форм ЦПД (на фото, слайдах, препаратах).

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания Для занятия необходимо иметь:  а)  заранее полученные культуры клеток (куриные фибробласты в норме и зараженные иирусом). Эти культуры будут использованы студентами как для поучения форм ЦПД и нормы клеток, так и для постановки

цитоплазму (вирус гриппа и др.), третьи же разрушают и ядро, и цитоплазму.

При исследовании под микроскопом клеточного монослоя отмечают следующие морфологические изменения при острой инфекции (рис.35):

реакции гемадсорбции; б) фиксированные окрашенные микропрепараты культур клеток в норме и с различными формами ЦПД.

При отсутствии регулярного получения культур клеток можно приготовить фиксированные препараты. Для этого надо получить культуру клеток. В пробирках с хорошим монослоем слить среду, отмыть клетки раствором Хенкса и залить 70°-ным спиртом. Такие препараты могут сохраняться много месяцев при комнатной температуре и быть использованы студентами для изучения клеток в норме и с ЦПД.

Вопросы домашнего задания

1. Клеточные и гуморальные механизмы противовирусного иммунитета.

2. Виды лабораторных животных и методы их заражения.

3. Правила вскрытия животных.

4. Взятие крови, получение сыворотки и плазмы, эритроцитов, лейкоцитов.

Животные	Вирус	Метод заражения
1	2	3
М Li ши	Гриппа человека и животных (лошадей, свиней)	Интраназально
		Хламидии (аборта овец, пневмоний, артритов, энцефалитов телят)	Интраназально, интра-перитонеально
		Бешенства	Интрацеребрально
		Трансмиссивных энцефалитов лошадей	Интрацеребрально
		Эктромелии (оспы мышей)	Внутрикожно, перито-неально
		Энцефалита Тейлора	Интрацеребрально
		Лимфоцитарного хориоменингита	Интрацеребрально
		Чумы птиц (грипп птиц А1)	Интраназально
11оворожден-IIWC мыши	Ящура	Подкожно
		Катаральной лихорадки овец	Интрацеребрально

ГЛАВА 3. БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

ЗАНЯТИЕ 12. Выделение и культивирование вирусов в ^ организме лабораторных животных

Цель занятия: освоить различные методы заражения и методику вскрытия трупов лабораторных животных, отработать •сошику взятия материала для вирусологического исследования, научиться получать различные компоненты крови.

Оборудование и материалы: лабораторные животные (кролики, белые мыши; морские свинки), шприцы и инструменты для заражения животных и взятия крови, вируссодержащий материал, трупы лабораторных животных, инструменты для вскрытия, раствор Хенкса, пенициллин, стрептомицин, пробки резиновые, пенициллиновые флаконы, стерильные марлевые салфетки, колбы с бусами, стерильные пробирки, колбочки на 50 мл, стерильная воронка, центрифуга, пробирки центрифужные, физиологический раствор, штативы, таблицы по теме.

Издавна лабораторных животных применяют для индикации вирусов в патматериале, т.е. для постановки биопробы. С оч'ой целью суспензией патматериала заражают лабораторных животных и учитывают реакцию на заражение. В вирусологической практике для диагностики бешенства ставят биопробу на мышатах, инфекционного бронхита кур — на цыплятах, нщура — на морских свинках, болезни Ауески — на кроликах и т.д. (табл.4).

Таблица 4

Восприимчивость лабораторных животных к вирусам

Продолжение таблицы 4

1	2	3
	Африканской чумы однокопытных	Интрацеребрально
	Лихорадки долины Рифт	Интрацеребрально
	Болезни Найроби	Интрацеребрально
Крысы	Лимфоцитарного хориоменингита	Интрацеребрально
	Эктромелии	Внутрикожно, интра-перитонеально
Хомяки	Гриппа	Интраназально
	Хламидии	Интрахеально
	Бешенства	Подкожно
	Бешенства	Интрацеребрально, подкожно, внутримы-шечно^ ректально
Морские свинки	Ящура	Внутрикожно в план-тарную поверхность задней лапки
	Осповакцины	Корнеально
	Осповакцины	Интрацеребрально
	Бешенства	Интрацеребрально
Хорьки	Гриппа животных	Интраназально
	Чумы плотоядных	Парентерально
	Инфекционного гепатита собак	Парентерально
Кролики	Коровьей оспы	Корнеально, внутрикожно
	Бешенства	Интрацеребрально
	Хламидий	Интрацеребрально
	Миксоматоза	Парентерально
	Фибромы кроликов	Подкожно, внутримышечно, в тестикулы
	Болезни Ауески	Подкожно, внутримышечно
	Ящура	Новорожденных крольчат внутримышечно
	Ринопневмонии лошадей	Беременных крольчих внутримышечно
Собаки	Чумы собак	Per os, внутримышечно
	Инфекционного гепатита собак	Парентерально
Кошки	Энтерита норок	Котят до 15 дней per os, парентерально
	Панлейкемии кошек	Парентерально
Куры	Гриппа птиц	Парентерально
	Ньюкаслской болезни	Парентерально
	Болезни Марека	Парентерально, суточных цыплят интрапе-ритонеально
	Инфекционного бронхита	Интратрахеально
	Оспы птиц	В перьевые фоликулы, гребень, сережки

73

Обычно признаки присутствия вируса в организме животно-|.'о малоспецифичны и не позволяют сделать вывод о том, какой кто вирус. Однако, бывают случаи, когда биопроба сопровождается характерной клинической картиной, специфичной для определенного заболевания. Тогда положительная биопроба позволяет сделать вывод не только с присутствии вируса в патматериале, но и его видовой принадлежности. Например, при зуде у кролика на месте введения патматериала, расчесов и разгрызаний — заражение вирусом болезни Ауески.

В настоящее время лабораторных животных  используют

для:

1) обнаружения вируса в патматериале;

2) первичного выделения вируса из патматериала;

3) накопления вирусной массы;

4) поддержания вируса в активном состоянии;

5) титрования вируса;

6) в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации;

7) получения гипериммунных сывороток.

При выполнении биопробы необходимы лабораторные жи-иотные различных видов — белые мыши, крысы, хомяки, морские свинки, хорьки, собаки, обезьяны, кролики, куры. Лабораторные животные должны быть получены из хозяйства, благополучного по инфекционным и инвазионным заболеваниям; они должны быть клинически здоровыми и иметь достаточный нес; во внимание обязательно принимают возраст животных (в некоторых случаях к вирусу наиболее чувствительны новорожденные, в других — можно использовать взрослых).

Животных перед заражением выдерживают в карантине 2...3 недели. За ними проводят клинические наблюдения и лабораторные исследования для исключения инфекционных и инвазионных болезней. Помещение, где содержатся животные, должно иметь отдельный изолированный вход, достаточно света, хорошую вентиляцию. Животных, зараженных вирусами, необходимо содержать в отдельном помещении.

Метка лабораторных животных. Метка является непременным условием использования животных в эксперименте. На клетке укрепляют бирку с надписью (номер экспертизы, количество зараженных животных, дату заражения и другие сведения).

Существуют и способы индивидуальной метки (рис.37). Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. Их надевают на корень уха (кроликам), вставляют в ушную раковину по типу серьги (морским свинкам), надевают на Horv (KVDaMl.

Для метки белых мышей и крыс

\ —   i-   у       у   чаще    всего    применяют    нанесение

\гг—: ^ цветных пятен на непигментирован-

Рис.37. Алюминиевые шерсть.   Насыщенный   раствор

жетоны для маркировки       ^{J е} „ ^г

лабораторных животных     пикриновой  кислоты   лучше   других

Рис.38. Цветная метка лабораторных животных

красителей удерживается на шерсти и коже животных. Цветные метки ставят в местах, соответствующих определенному порядковому номеру животного. Так, если его тело разделить условно на три продольные части (левый бок, спина, правый бок), то нанесение цветных меток начинают с левого верхнего угла, т.е. лопатки; это будет соответствовать 1. Двигаясь назад, левый бок соответствует 2, левое бедро — 3, далее затылок — 4, спина — 5, область репицы — 6, правое плечо — 7, правый бок — 8, правое бедро — 9. Используя два цвета красителей, можно дать одним из них обозначения единиц, другим — десятков (рис.38).

Исследуемым материалом рекомендуется заражать сразу нескольких животных разными способами, но с учетом тропизма вируса. Поскольку при первичном заражении животное может не заболеть, через 5...7 дней здоровых на вид животных убивают, а их органы используют для заражения следующей партии. Делают обычно три таких "слепых" пассажа.

Вируссодержащий материал может быть введен лабораторным животным различными методами. Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Зная тропизм, материал вводят в органы, содержащие чувствительные к этому вирусу клетки. Например, вирус гриппа • вводят интраназально, вирус бешенства— интрацеребрально.

Применяют следующие методы заражения.

Заражение под кожу: вируссодержащий материал вводят под кожу в область спины. Доза его для крыс— 0,5 мл, морских свинок — 3 мл, белых мышей — 0,2 мл. Если нужно ввести большее количество материала, то жидкость инъецируют в разные места под задний конец спины или в различных направлениях (рис.39).

Внутримышечное заражение: исследуемый материал вводят в мышцу бедра (у кур — в грудную мышцу). Доза для мышей 0,25 мл,

Рис.39. Подкожное заражение белой мыши

Рис.40. Внутримышечное заражение морской свинки

Рис.41. Кролик, накожное заражение

Накожное заражение: (освобожденной от шерсти)

крыс— 0,5...1 мл, морских свинок — 2 мл, кроликов — 5 мл, кур — 3 мл (рис.40).

Внутрикожное заражение: тонкую острую иглу вводят под острым углом в складку кожи, предварительно освобожденную от волос. В результате инъекции должен образоваться пузырек. Доза вируссодержащего материала для всех животных 0,1...0,2 мл. на предварительно подготовленной продезинфицированной коже скарификатором делают царапины, затем каплями наносят вируссодержащий материал и втирают стеклянным шпателем, этот метод широко используют при работе с вирусами оспенной группы (рис.41).

Внутрибрюшинное заражение:   животное фиксируют   в   вертикальном     положении головой    вниз.    Для инъекции используют затупленные       иглы. Кожу,        мышечную стенку и брюшину забирают  в   складку  и прокалывают их иглой под прямым углом до Рис.42. Интраперитонеальное заражение:     ощущения пустоты — а — взрослой мыши; б — новорожденного     показатель   проникно-мышонка вения иглы в брюш-

ную полость. Дозы вируссодержащего материала: мышам — 1 мл, крысам — 2 мл, морским свинкам — до 5 мл, кроликам — до 10 мл, овцам и козам — 50...100 мл (рис.42).

Внутривенное заражение: исследуемый материал мышам и крысам вводят в хвостовую вену, кроликам — в ушную, курам — в вену крыла, более крупным животным — в яремную вену, морским свинкам— 1...2 мл непосредственно в сердце. У мышей и крыс хвост надо предварительно погрузить на 5... 10 мин в теплую воду (48...50 °С). Иглу вводят под острым утлом в боковую вену задней трети хвоста. Дозы материала: для мышей — 1 мл, крыс— 2 мл, кроликов— до 5 мл, для кур— до 10 мл (рис.43, 44, 45).