Правила работы в вирусологической лаборатории

коллодия; 7 — кран

Приготовление пленок-подложек из формвара. Для приго товления пленок применяют 0,1...0,2%-ный раствор формвара (поливинилформальдегид). Растворителями для него служат ди-оксан, дихлорэтан, хлороформ. Раствор следует готовить за одни сутки до употребления, хранить в сосуде с притертой крышкой в темном месте, срок годности до 6 мес.

Предметное стекло, чисто вымытое и тщательно протертое, быстро опускают в сосуд с раствором формвара, через 5... 10 с вынимают и подсушивают. Сушить следует 40...60 с до исчезновения запаха растворителя. Образовавшуюся пленку можно обнаружить, если подышать на стекло. Полученную пленку подрезают лезвием бритвы, затем снимают ее на воду, погружая стекло под углом 45°. На пленку укладывают сетки, сверху покрывают кружком фильтровальной бумаги и извлекают. Сетки с пленкой высушивают и хранят в чашках Петри (рис.20).

Нанесение  исследуемого материала  на сетку с пленкой-подложкой   осуществляют   несколькими методами, например: 1) на сетку с пленкой наносят каплю суспензии вирусных частиц.     Жидкость     отсасывают фильтровальной     бумагой     и 30...60 с сетку сушат на воздухе. РисГгО. Приготовление пленок-     Затем   не   нее   наносят   каплю подложек из формвара: контрастирующего   вещества   и

1 — предметное стекло; через  1  мин отсасывают  жид-

2 — сосуд с формваром кость.  Препарат готов для исследования;

2) смешивают суспензию вирусных частиц и контрастирующее вещество в отношении 1:1. Затем наносят смесь на сетку с помощью пипетки, как и в первом случае, после высыхания препарат готов для исследования.

Метод негативного контрастирования. Сущность метода состоит в том, что биологический объект помещают в вещество

высокой электронной плотности, в результате   чего   малоконтрастный объект становится более отчетливо различим на окружающем его темном фоне. В этом случае получается негативный эффект (рис.21). Для негативного контрастирования используют соли тяжелых металлов. К ним предъявляют следующие требования: не реагировать химически с объектом, при высыхании давать аморфный осадок; не изменять структуру под электронным пучком. Наибо-.... — -' •—»• лее    широко    сейчас    применяют

1...2%-ные растворы фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) на дистиллированной воде, рН 7,0...7,4 (доводить рН следует 1 N КОН), или 2%-ный раствор уранилацетата в дистиллированной воде. Разрешающая способность этого метода достигает 12 ■ Ю^-10 м (рис.22). / „ ' • " Электронная микроскопия позволяет обнаружить вирионы в исследуемом материале, определить их форму и размеры. Для изучения внутренней структуры вирусов гото-

Рис.22. Скопления внеклеточных вирионов реовируса (негативное контрастирование) х500000

вят ультратонкие срезы (2 ■ 10~⁸ м и менее) биологических объектов, используя специальные ультрамикротомы.    В    результате    электронно

Рис.23. Ультратонкие срезы вируссодержащего материала:

а) скопление внеклеточного Д-типа онковируса в клетках HeLa. х70000; б, в) внеклеточные Д-типа онковирусы клеток HeLa. х370000; г, д) внеклеточные Д-типа онковирусы клеток Нер-2. х370000

микроскопического исследования срезов оказался возможным анализ молекулярной структуры вирусов (рис.23).

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Ознакомиться о устройством электронного микроскопа.

2. Приготовить препараты для электронной микроскопии.

3. Провести электронноскопическое исследование вирусов.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация сеточек для приготовления препаратов; растворов для получения пленок-подложек; контрастирующих растворов; ножей для ультрамикротомирования; готовых блоков для резки; микрофотографий.

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания При отсутствии на кафедре электронного микроскопа необходимо иметь хотя бы хорошо выполненную схему его устройства и работы.

На занятии надо иметь набор электронных микрофотографий разных вирионов (на каждого студента не менее одной). Такие фотографии можно заказать в учреждении, занимающимся электронной микроскопией вирусов. На первый случай можно воспользоваться фоторепродукциями.

Вопросы домашнего задания

1. Генетика вирусов.

2. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ В УСЛОВИЯХ ЛАБОРАТОРИИ

ЗАНЯТИЕ 7. Культивирование вирусов путем заражения развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ)

Цель занятия: изучить анатомию развивающихся куриных эмбрионов, ознакомиться с методами заражения их вируссодержащим материалом.

Оборудование и материалы: куриные эмбрионы, вируссо-держащий материал (например, вирус осповакцины), шприцы, короткие и длинные иглы, подставки для РКЭ, овоскопы или осветители ОИ-19, пробойники и глазные пинцеты в баночке со спиртом, вата, 0,5%-ная настойка йода, стерильный парафин в пастеровских пипетках, стерильные покровные стекла или стеклянные колпачки, лейкопластырь, чашки Петри, спиртовки, простые карандаши, стерильные тампоны, таблицы по теме. ¹ у Краткие теоретические сведения

_i Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусологическую практику в 30-х годах XX века. Их использование расширило спектр культивируемых в лаборатории вирусов и позволило более успешно решать стоящие перед вирусологией задачи. Объясняется это тем, что РКЭ имеют ряд преимуществ перед другими живыми системами:

1) это закрытая живая система. Скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального заражения;

2) у РКЭ высокая чувствительность к широкому спектру вирусов (недостаточное развитие защитных механизмов);

3) РКЭ — легкодоступный объект;

4) РКЭ — экономичная живая система, не требующая ухода

и кормления;

5) РКЭ не образуют антител в ответ на заражение. Куриные эмбрионы используют в вирусологии для:

1) обнаружения в патматериале активного вируса или первичного выделения вируса. Эффективно выделяют и культивируют на куриных эмбрионах вирусы, вызывающие заболевания у птиц, а также некоторые вирусы млекопитающих;

2) поддержания вирусов в условиях лаборатории;

3) титрования вирусов;

4) накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин;

5) реакции нейтрализации, как тест-объект.

При отборе куриных эмбрионов для заражения вируссодер-жащим материалом к ним предъявляют следующие требования: эмбрионы должны быть получены из хозяйств, благополучных по

Рис.24. Развитие куриного эмбриона

В процессе инкубации меняются размеры зародышевых структур, что во многом объясняется их функциональным назна-чонием и определяет оптимальные для заражения возраст эм-Приона. Так, желточный мешок, как резервуар питательных веществ, имеет наибольший объем в начале инкубации, а затем, после 12-го дня, по мере развития зародыша, он уменьшается. Варажают в желточный мешок с 5-го по 7-ой день инкубации.

Амниотическая полость, являясь буферной средой развития оиродыша, покрывает его уже на 5-й день инкубации. Среднее количество жидкости к середине периода инкубации составляет около 1 мл. Для заражения в амниотическую полость используют эмбрионы в возрасте 6-10 дней.

Аллантоисная полость служит для сбора продуктов обмена, и ней скапливаются мочекислые соли, фосфорные и азотистые соединения. В процессе роста и развития зародыша аллантоисная жидкость приобретает кислую реакцию. Максимальных размеров аллантоисная полость достигает на 9-12-ый день развития эмбриона, поэтому заражение в нее проводят преимущественно на 9-11-й день инкубации.

Хорион-аллантоисная оболочка богата кровеносными сосудами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности пористой скорлупы, насыщаются кислородом и снабжают им тело зародыша, выполняя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11-13 день. Заражение на хорион-аллантоисную оболочку проводят на 10-12 день инкубации.

Подготовка РКЭ для заражения. Эмбрионы доставляют из инкубатора, не допуская охлаждения в пути. В лаборатории их инкубируют в термостате при 37 °С и 60...70% влажности. Для этого в термостат помещают открытые широкогорлые сосуды с водой. Эмбрионы ставят в специальные штативы воздушной камерой вверх.

Поступившие в лабораторию РКЭ овоскопируют и отмечают простым карандашом границу воздушного пространства (пуги), тело и головку эмбриона (X), безсосудистую зону (Д). Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. При овоскопировании определяют жив зародыш или погиб. Зародыш, проявляющий активные движения при хорошей кровенаполненности сосудов ХАО, считается живым.

Заражение проводят в боксе. Рабочее место должно быть хорошо освещено. Перед началом работы стол дезинфицируют спиртом, поджигая его на столе. Готовят следующие инструменты и принадлежности: комочки ваты для дезинфекции поверхности скорлупы, 0,5%-ную настойку йода, пробойники, шприцы, иглы, парафин в пипетках, подставки для эмбрионов (рис.25). После этого рабочий стол в течение 1 ч облучают УФ-лучами.

инфекционным заболеваниям, скорлупа яиц должна быть непиг-ментированной, чистой (мыть нельзя). Возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения.

Строение куриного эмбриона. Обычно курица откладывает оплодотворенное яйцо, в котором зародыш находится на стадии бластулы или ранней гаструлы. При нагревании яйца до температуры, близкой к температуре тела курицы, происходит дальнейшее развитие зародыша. В период с 5-го по 12-й день инкубации куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения вирусами.

Куриное яйцо заключено в скорлупу, через ее поры совершается газообмен. Под ней лежит подскорлупная (белковая) оболочка. Это своеобразная буферная система между содержимым яйца и скорлупой. Подскорлупная оболочка в тупом конце яйца разделяется на два листка, между которыми образуется воздушная камера (пуга). Непосредственно под подскорлупной оболочкой находится хорион-аллонтоисная оболочка (ХАО — сосудистая оболочка), которая формирует аллонтоисную полость, заполненную жидкостью. На 11-12-й день развития количество ее достигает 6...7 мл. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш погружен в амниотическую жидкость, заполняющую амниотическую полость, сформированную из амниотической оболочки. Количество амниотической жидкости к 10-11-му дню развития эмбриона составляет в среднем 1 мл. Зародыш пуповиной связан с желтком, который располагается эксцентрично. Этот резервуар питательных веществ имеет наибольший объем в начале инкубации, а по мере развития зародыша он уменьшается. Кроме того, в полости РКЭ находится белок, покрытый оболочкой, являющийся питательным материалом для "эмбриона (рис.24.).

Размножение вирусов возможно во всех структурах эмбриона, имеющих клеточное строение, к которым относятся зародыш, ХАО и желточный мешок. Накопление вирусов происходит в тех же структурах, но целый ряд их может накапливаться в аллантоисной и в амниотической жидкостях, образуя практически готовую суспензию вирусов. Заражение в ту или другую область эмбриона проводится в период ее максимального развития, когда количество чувствительных клеток будет наибольшим.

Рис.25. Рабочее место для заражения РКЭ

Способы заражения. Существует ряд способов заражения эмбрионов (рис.26). При любом из них скорлупу яйца над местом введения материала обрабатывают спиртом, обжигают, затем обрабатывают слабым раствором йода и вновь обжигают.

Одним из распространенных в вирусологии способов является заражение на хорион-аллантоисную оболочку. Оно применяется в тех случаях, когда, вирус хорошо размножается в клетках этой оболочки (поксвирусы — вирусы оспы, осповакцины, эктро-мелии; герпесвирусы — вирус ларинготрахеита; онкорнавирусы — вирус лейкоза кур и др.) Для этой цели используют 11-14-дневные РКЭ.

Техника заражения сводится к следующему. В центре воздушной камеры снимается часть скорлупы и в результате обнажается подскорлупная оболочка. Ее приподнимают и удаляют — обнажается прозрачная, блестящая, красная, пронизанная кровеносными ссудами хорион-аллантоисная оболочка. На нее пипеткой наносят вируссодержащий материал в дозе 0,1-0,2 мл. После этого окошечко в скорлупе закрывают стерильным покровным

Рис.26. Способы заражения РКЭ: а — на хорион-аллантоисную обЬйочку; Ъ —■ в аллантоисную полость; виг — в амниотическую * * полость; д — в желточный мешок

стеклом, стеклянным колпачком или лейкопластырем, края заливают стерильным парафином.

Заражение в аллантоисную полость наиболее часто применяют при культивировании тех вирусов, которые размножаются в клетках эпителия (орто- и парамиксовирусы, онкорнавирусы, герпесвирусы и др.). Вирус при этом поступает в аллантоисную жидкость, накапливаясь в ней в высоких концентрациях (вирус гриппа). Возраст куриных эмбрионов должен быть 10-11 суток.

Вируссодержащий материал можно вводить двумя способами.

1. Делают прокол в скорлупе над центром воздушной камеры. Через отверстие шприцем с короткой иглой, который держат 1) вертикальном положении, вводят материал (0,1...0,2 иногда 0,5 мл) на 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Затем отверстие в скорлупе заливают стерильным парафином или закрывают лейкопластырем.

2. Делают два прокола — первый в скорлупе над воздушной камерой, второй — над безсосудистой зоной. Через второе отверстие с помощью шприца вводят материал (0,1...0,2 мл) прямо в аллантоисную полость. Для того, чтобы жидкость не выливалась обратно, через первое отверстие пипеткой с резиновой грушей отсасывают воздух, затем оба отверстия заливают парафином.

Заражение в амниотическую полость — самый эффективных метод выделения ряда орто- и парамиксовирусов. При этом способе вирус размножается в органах и тканях эмбриона. Для заражения обычно используют 6... 11-дневные эмбрионы. Следует отбирать такие эмбрионы, у которых зародыши близко расположены к воздушному пространству.