Правила работы в вирусологической лаборатории

Рис.32. Магнитная   клетки. К оставшейся ткани добавляют вто-мешалка рую порцию трипсина, и колбу снова поме-

щают на магнитную мешалку. Скорость вращения регулируют так, чтобы не наступало вспенивания содержимого колбы. Трип-синизацию проводят 3-4 раза, до полного истощения ткани, которое определяют по белесоватому оттенку кусочков и их разбуханию. После окончания трипсинизации полученную взвесь клеток 10...15 мин подвергают центрифугированию при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспензиру-ют в питательной среде (1:10), подогретой до 37 °С, и сливают в колбу через 3-4 слойный марлевый фильтр. После тщательного перемешивания суспензии клеток берут две ее пробы по 0,5 мл. К каждой из них добавляют по 0,5 мл 0,1%-го кристаллвиолета в 0,1N растворе лимонной кислоты. После перемешивания каплю суспензии помещают в счетную камеру Горяева и подсчитывают клетки, имеющие хорошо заметное ядро и неповрежденную цитоплазму. Клетки подсчитывают не менее как в трех больших квадратах камеры. Из полученных данных находят среднее арифметическое. Количество клеток в 1 мл определяют по формуле

_v    а•4000 б

-Л — -,

в

где а — среднее количество клеток в малом квадрате; б — степень разведения; в — количество подсчитанных малых квадратов.

Точный подсчет клеток необходим, поскольку качественный монослой можно получить лишь при определенной оптимальной посевной дозе. В соответствии с результатами подсчета к суспензии добавляют необходимое количество питательной среды, чтобы в 1 мл содержалось 250...300 тыс. клеток (оптимальная доза). К питательной ростовой среде добавляют 10% бычьей сыворотки и антибиотики — пенициллин,  стрептомицин,  тетрициклин (по

100 ЕД/мл), устанавливают рН 7,2...7,4. Схема, получения культуры клеток представлена на рис.33.

Для культивирования клеток в каждую пробирку засевают I... 1,5 мл суспензии; во флаконы емкостью 100 мл — 20 мл, ИМ) мл — 40 мл, 1л — 100 мл клеточной взвеси. Флаконы и пробирки плотно закрывают стерильными резиновыми пробками.

9 10

Рис.33. Схема получения культуры клеток: 1 — извлечение эмбриона; 2 — отсечение головы, измельчение; 3 — многократное промывание; 4 — трипсинизация; 5 — объединение взвеси клеток в сосуде на таящем льду; 6 — центрифугирование и удаление трипсина; 7 — ресуспензирование осадка в небольшом количестве среды, подсчет; 8 — доведение до нужной концентрации; 9 — посев клеток в сосуды; 10 —- термостатирование

На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту, укладывают их чертой вверх в ящики с наклонным дном (угол 6°) и помещают в термостат при 37 °С.

Клетки фиксируются на внутренней поверхности пробирки. Через 24...48 ч образуется сплошной слой клеток,  располагающихся  в

_    „. „ о один ряд (монослой, рис.34).

Рис.34. Монослои куриных „ „„       ~__«„,,..

фибробластов. Световая ^{В хо}^^е самостоятельной работы

микроскопия, х7 студентов необходимо

1.   Отобрать  хорошо   развитые куриные эмбрионы в возрасте 7... 10 дней.

2. Вскрыть эмбрионы и получить кожно-мышечный мешок.

3. Провести трипсинизацию кожно-мышечной ткани куриного эмбриона.

4. Провести центрифугирование и подсчет клеток в камере Горяева.

5. Подготовить взвесь клеток в ростовой питательной среде в концентрации 200 тыс./мл, используя результаты подсчета в камере Горяева и рекомендуемую выше формулу.

6. Провести разлив клеточной взвеси по пробиркам.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация преподавателем каждого этапа трипсинизации.

4. Самостоятельная работа студентов: подготовить рабочее место для трипсинизации; подготовить куриные эмбрионы для триисинизации; провести трипсинизацию, получить суспензию клеток необходимой концентрации и разлить ее по пробиркам.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

При выполнении трипсинизации студентов делят на 2 подгруппы (в зависимости от наличия на кафедре материальных средств). Самая главная подготовка к этому занятию — обеспечение стерильной посудой, инструментами, средами, растворами, которые должны быть заранее подготовлены.

При отсутствия условий регулярного получения культур клеток можно приготовить фиксированные препараты. Для этого надо предварительно получить культуру клеток в пробирках, отмыть клетки раствором Хенкса и залить 70°-ным спиртом. Такие препараты могут сохраняться много месяцев при комнатной температуре.

Главное, что обеспечивает успех получения первичных культур клеток, — это полная стерильность инструментов, посуды и материала, а также сохранение стерильности при манипу-пнции с ними.

Вопросы домашнего задания

1. Клеточные и гуморальные механизмы противовирусной шнциты.

2. Перевиваемые культуры клеток.

3. Техника заражения клеточного монослоя.

4. Формы цитопатогенного действия (ЦПД).

ЗАНЯТИЕ 11. Перевиваемые культуры клеток

Цель занятия: ознакомиться с некоторыми перевиваемыми клотками (HeLa, С-18, амниона человека и др.), культурой диплоидных клеток, техникой заражения культуры клеток вируссо-доржащим материалом, изучить формы цитопатогенного действия

(ЦПД).

Оборудование и материалы: пробирки с культурами пер-нично-трипсинизированных и перевиваемых клеток в норме и после заражения с признаками ЦПД вируса, подставки для пробирок, пастеровские и градуированные пипетки, микроскопы, (жствор версена, бычья сыворотка, 7,5%-ный раствор соды, пенициллин, стрептомицин, тетрациклин, поддерживающие среды, иируссодержащий материал, таблицы по теме, диапозитивы. Краткие теоретические сведения

Одним из методов получения перевиваемых клеток является отбор клеток первичной культуры с повышенной активностью роста. Отбор осуществляют при регулярной смене среды. Для поддержания отобранных клеток в жизнеспособном состоянии питательную среду каждые 3...4 дня заменяют свежей. Обычно работа по получению перевиваемых клеток продолжается в течение многих месяцев.

В результате подбора специальных питательных сред, режима культивирования удается адаптировать отдельные клетки к определенной питательной среде и перевивать их очень долго. Клетки, которые приобрели способность к длительному пассированию вне организма, получили название перевиваемых. Таким образом, перевиваемые клетки — это такие клетки, которые перевиваются из одного сосуда в другой при условии замены питательной среды с сохранением потенциальной возможности к дальнейшему размножению.

К перевиваемым клеткам из нормальных тканей относят: штамм L (мышиные фибробласты, 1943), СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус, 1957), С-18 (из эмбриональной почки поросенка, 1.960), ФК (фибробласты крысы, 1954) и др.

 

Перевиваемые клетки из опухолевой ткани включают: HeLa (клетки рака шейки матки женщины, 1952), Нер-2 (клетки карциномы гортани человека, 1955), Нер-3 (клетки лимфоидной карциномы человека, 1955) и др.

Разновидностью перевиваемых клеток являются диплоидные клетки. Это морфологически однородные культуры, стабилизированные в процессе культивирования in vitro, имеющие ограниченный срок жизни (не более 50 пассажей), сохраняющие правильный диплоидный набор хромосом, свойственный исходной ткани, свободные от посторонних вирусов и микробов и не обладающие онкогенной активностью.

Необходимо отметить, что для некоторых зоопатогенных  вирусов наиболее употребимы определенные виды перевиваемых клеток (табл.3), например, ВНК-21 для вируса ящура, РК-15 — для вируса чумы свиней, диареи крупного рогатого скота, ПЭК — для вируса ринотрахеита, ТБ — для вируса герпеса и т.д. Поэтому ряд видов культур клеток надо уметь сохранять в условиях лаборатории. Основным способом длительного сохранения перевиваемых клеток является их глубокое замораживание (до -70 °С) в присутствии глицерина, сыворотки крови с последующим хранением ампул в жидком азоте (-196 °С). Все это способствует длительному (до 5...6 месяцев) сохранению клеток.

Перевиваемые клетки имеют следующие преимущества перед первично-трипсинизированными:

1. Они обычно не  загрязнены посторонней микрофлорой,  как это часто наблюдается  в первичных культурах.

2. Большинство их обладает  более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры. Это зависит от происходящих в них физиологических изменений.

3. Для изготовления  перевиваемых клеток требуется  меньше средств и труда по сравнению с приготовлением первичных культур.

4. Эти клетки чаще, чем первичные культуры, используются для выделения вирусов из материалов, содержащих бактерии, поскольку менее чувствительны к высоким концентрациям антибиотиков (результат адаптации при пассировании в питательной среде с антибиотиками).

5. Для перевиваемых  клеток характерна вирусологическая стерильность (отсутствие спонтанного вирусоносительства).

Вместе с тем, перевиваемые клетки имеют и ряд недостатков, которые в известной степени ограничивают их применение. Они склонны к малигнизации, т.е. злокачественному перерождению, независимо от происхождения, требуют постоянного пассирования с использованием свежей среды, подвержены неспецифической дегенерации (изменяется морфология и снижается чувствительность к вирусам).

Перевивание клеток производят в следующем порядке:

1. Снятие клеточного монослоя. Растущие клетки довольно прочно прикрепляются к поверхности стекла под слоем питательной среды. Снять их можно механическим путем (соскабливанием). Однако, это грубый прием, ведущий к значительному повреждению клеток. Чаще применяют 0,02%-ный раствор версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов, в частности магния и кальция, т.е. тех ионов, которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки отделяются от стекла, округляются и образуют взвесь. Из сосудов с развившимся клеточным монослоем сливают питательную среду, добавляют 0,5...1 мл подогретого до 37 °С раствора версена и выдерживают в термостате 20...30 мин при периодическом покачивании.

2. Отделение клеток. Взвесь клеток в версене помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 800...1000 об/мин в течение 7...10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Подсчет клеток проводят в камере Горяева так же, как и при получении первичных культур.

3. Посев клеток. После подсчета исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации. Приготовленную взвесь вносят при помешивании на магнитной мешалке или пипетированием в пробирки или матрасы и закрывают резиновыми пробками. Посевная доза клеток в пробирки 80...100 тыс/мл, матрасы, флаконы — 25...30 тыс/мл полезной площади. На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту (чертой кладут вверх), засеянные клетки культивируют в термостате при 37 °С в течение 3...4 суток до образования сплошного монослоя. Полученный монослой сохраняет при 37 °С жизнеспособнбсть в течение 5... 10 суток в зависимости от вида клеток и состава питательной среды. В течение этого срока клетки можно отделить от стекла, подвергнуть транспортировке или использовать для длительного хранения.

Транспортируют клеточные культуры чаще всего авиапочтой в герметически закрытых сосудах. При этом следует избегать резких колебаний температуры, особенно замерзания или перегревания. По мере старения клеток производят пассаж - переносят их в пробирки со свежей питательной средой.

Заражение культуры клеток. Для заражения вируссодержащий материалом отбирают пробирки с наличием сплошного клеточного монослоя, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Питательную среду удаляют, и в каждую пробирку вносят по 0,1...0,2 мл вируссодержащего материала, подлежащего исследованию, и оставляют ее в наклонном положении. После 30...60 мин контакта материала с клетками в пробирки добавляют 1...1.5 мл поддерживающей (без сыворотки) среды. Для каждой пробы вируссодержащего материала используют не менее четырех пробирок (4-6) с культурой клеток. Каждое исследование сопровождают контролями:

а) контроль монослоя в норме (4-6 пробирок). В этом случае из пробирок удаляют ростовую питательную среду и заменяют ее 1 юд держивающей;

б) контроль монослоя, инфицированного эталонными штаммами вирусов (4-6 пробирок). При этом пробирки с культурой клеток заражают известными (эталонными) вирусами;

в) контроль монослоя, контактировавшего с экстрактом аналогичной ткани, не зараженной вирусом. Для этого берут не-иараженную ткань, аналогичную той, где предполагается наличие вируса. Из нее готовят материал и заражают 4-6 пробирок с культурой клеток.

Все пробирки помещают в ящик с наклонным дном (угол 6°) так, чтобы монослой оказался под питательной средой (чертой вверх) и инкубируют в термостате при 37 °С. Клетки ежедневно микроскопируит под малым увеличением микроскопа (объектив х8 или х10), сравнивая культуры, зараженные вирусом, с контрольными.

Формы ЦПД. При взаимодействии вирусов с клетками в последних наблюдаются различные морфологические изменения, которые обусловливаются рядом факторов, особенно степенью чувствительности клеток культуры к вирусу и условиями среды.

Контакт вирусов с восприимчивыми клетками сопровождается острой или латентной инфекцией и неопластической трансформацией последних. При инфекции отмечаются деструктивные изменения в зараженных клетках, часто приводящие к их гибели. Все морфологические изменения, возникающие под воздействием вируса, называют цитопатическим действием (эффектом), сокращенно ЦПД (ЦПЭ). При латентной инфекции репродукция вируса в зараженных клетках не приводит их к гибели, и внешне они не отличаются от нормальных (не зараженных).

Первоначальный этап взаимодействия вирусов с клеткой — это изменение некоторых звеньев обмена веществ, которые можно выявить определенными гистохимическими реакциями. Одним из ранних проявлений такого взаимодействия является увеличение размеров ядра (дезинтегративное набухание). Эта реакция неспецифична, поскольку она не зависит от биохимического состава и размера вирусов, их биологических свойств. Денное явление характерно для вирусов, вызывающих как острую, тек и хроническую инфекцию.