Правила работы в вирусологической лаборатории

Этот пример титрования вирусов является упрощенным, так как он не учитывает случаев высокой концентрации вируса в материале, при которой бляшки или оспины могут сливаться между собой, и их невозможно будет сосчитать. Обычно счету поддаются бляшки и оспины, количество которых не превышает 50 на матрас или ХАО. Поскольку титр вируса в исследуемом материале обычно не известен (он подлежит определению),то неизвестно, в каком разведении надо брать материал для заражения, чтобы избежать слияния бляшек или оспин.

В этом случае готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала (Ю^-1, 10^-2, 10"^ и т.д.) и каждым разведением заражают равные группы культур клеток или куриных эмбрионов. Подсчитывают количество бляшек или оспин, рассчитывают среднее арифметическое. Титр вируса находят, по формуле:

_т _   а_г+а₂ + ... + а_п V(n_x +п₂ + — + п_л)'

Допустим, вируссодержащий материал в разведении 10~³ вызвал образование 107 оспин; Ю^-4 — 19; 10~⁵— 7. Подставляя эти данные в формулу, получим:

_т_ 107 + 19 + 7_   133 10~⁶

0,2(1/1000 +1/10000 + 1/100000) ~   2-111

= 59000 ООЕ/0,2 мл.

Метод титрования вирусов в БОЕ дает наиболее достоверные данные об их концентрации, но могут возникнуть технические трудности, связанные с получением и подсчетом бляшек. Что касается оспин, то их использование для титрования ограничивается довольно немногочисленными вирусами, способными образовывать узелки на ХАО куриных эмбрионов.

Определение титра по инфекционным единицам 50%-го действия вирусов на чувствительные живые объекты. Наиболее универсальным является метод определения титра вируса в единицах 50% -го инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимают такую его дозу, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50% зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД₅₀— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вирусов в единице объема материала и есть его титр в данном материале.

Но, в зависимости от вида объекта и характера его поражения название эффективной дозы может изменяться. Если вирус вызывает гибель зараженных лабораторных животных, титр обозначают символом ЛД50 (летальная доза 50% использованных для заражения животных). Если же вирус вызывает только определенные признаки болезни, титр обозначают ИД₅₀ (инфекционная доза для 50% зараженных животных). При титровании на куриных эмбрионах и гибели их титр обозначают как ЭЛД₅₀* (эмбриональная летальная доза); при учете лишь пато-логоанатомических изменений в курином эмбрионе — ЭИД₅₀ (эм-брион-инфицирующая доза); в случае проявления ЦПД в культуре клеток — ТЦД₅₀ (тканевая цитопатическая доза).

Титр вируса выражают в количестве инфекционных доз, приходящихся на единицу объема. Например, 10³-⁴⁸ ТЦД_{50/0 2 мл}; 10⁴.5 ЕИД_50/0.2_Мл; Ю⁷'⁴⁵ ЛДзо/0,2 мл-

Титрование вирусов по 50%-му инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный практически для любого вируса, если подобрать к нему живую систему (тест-объект). Однако, этот метод довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов. В настоящем практикуме мы приводим два метода титрования вирусов по 50%-му эффекту.

1. Метод Рида и Менча основан на принципе кумуляции (накопления). Предполагается, что если чувствительные объекты погибают после заражения небольшими дозами вируса, они обязательно погибнут и при введении им более концентрированных доз и наоборот, объекты, остающиеся в живых после введения вируссодержащего материала в небольшом разведении, не погибнут, если их заразить этим же материалом в максимальном разведении. Принцип кумуляции позволяет искусственно увеличивать число исследуемых объектов и тем самым повысить точность эксперимента.

При определении титра вируса по Риду и Менчу поступают следующим образом. Из исследуемой суспензии готовят ряд последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала (Ю^-1, 10"², 10~³, 10"¹⁰). Делают это по двум причинам: а) удобство в расчетах; б) инфекционное действие вируса убывает прямо пропорционально его разведению. Вируссодержа-щим материалом в каждом разведении заражают группу чувствительных объектов (в каждой группе не менее 4-6) с целью удобства статистической обработки. За зараженными объектами устанавливают регулярное (не реже одного раза в сутки) наблюдение и фиксируют результат. Изменения в первые 48 ч после заражения трудно признать результатом действия вируса, особенно в высоком разведении, их считают неспецифическими и в расчет не принимают.

В табл.5 представлена схема титрования вируса. Вируссодержащий материал использован в 8 разведениях, каждым разведением заражено 4 животных (доза 0,2 мл).

При заражений вируссодержащим материалом в разведении 10~⁷ не наблюдалось гибели животных, следовательно, летальность здесь равна 0, и выживших мышей будет 4. Но к ним надо прибавить животных, оставшихся живыми после введения вируссодержащего материала в разведениях 10^_6, 10~⁵ и т.д. Таким образом, кумулятивное число выживших животных при заражении вируссодержащим материалом в разведении Ю^-' окажется равным 12. Активностью вируссодержащего материала в разведении 10~⁸ можно пренебречь, так как эффект в данном случае аналогичен таковому при исследовании вируссодержащего материала в разведении lO^-*

Рассуждая подобным образом, находим значение кумулятивной летальности. Оно составляет при разведении вируссодержащего материала Ю^-2 12 животных. Показания, полученные при использовании вируссодержащего материала в разведении Ю^-1, по той же причине можно во внимание не принимать.

Вируссодержащий материал в разведении, давшем эффект выше 50%, обозначают буквой В, ниже 50% — буквой А, процент летальности соответственно — b и а. Расчет производят по формуле:

, , „ fe-50 , , ^ЛД₅₀ =lg-B + --xlgd,

о - а

где В — доза вируса, дающая эффект более 50%; А —- доза вируса, дающая эффект менее 50%; b, а — эффект дозы соответственно В и А, %; d — интервал между двумя соседними дозами.

Подставляя в формулу данные табл.5, получим: lg ЛД₅₀ = lg Ю-⁴ + х lg КГ¹ = -4,5.

Таким образом, ЛД50 при указанном способе титрования иируса на мышах равна разведению Ю^-4-⁵. Зная, что вируссодер-жащий материал использован в объеме 0,2 мл, можно высчитать концентрацию вируса в исходной вирусной суспензии. В 0,2 мл :>той суспензии будет содержаться 10⁴>⁵ ЛДбо- Значит, титр вируса будет составлять: Г = 10⁴-⁵ ЛД₅₀/о,2 мл ^{или 5} • 1°^4,5 ЛД50/1 _мл-Найдем абсолютное значение разведения, соответствующее 1 ЛД₅о- В расчет принимают цифру 4,5. Число 4 показывает, что в абсолютной цифре должно быть 5 знаков (4 + 1). А антилогарифм цифры 4,50 составляет 3162. Но поскольку в ней только 4 знака, значит пятый знак приписывают в виде 0 и получают 31620. Значит, для нашего примера 1 ЛД50 равна разведению вируса 1:31620.

2. Метод Кербера. Этот метод считается более простым, не требующим расчета кумулятивных данных, пригоден и в случаях положительного эффекта от неспецифических причин. Но для получения достоверных результатов необходимо, чтобы положительные данные были известны в диапазоне от 0 до 100%.

Рассчитаем ЛД50 для результатов, приведенных в табл.5. Разведение вируса Выжило Пало

Ю-¹ 0 4

Ю-² 0 4

ю-³ 1 3

Ю-⁴ 1 3

Ю-⁵ 3 1

10"⁶ 3 1

Ю-⁷ 4 0

10"⁸ 4 0 ЛД50 высчитываем по следующей формуле:

1_&лд₅₀ =i_gD ₊ ^l-^-\gdi~,

где D — высшее разведение вируса, еще дающее 100% -ный эффект; d — коэффициент разведения; л — количество зараженных тест-объектов на каждое разведение; г — количество положительно  реагирующих  тест-объектов  на  каждое  разведение; п

Yj^rlⁿ — сумма отношений положительно реагирующих тест-i=l

объектов к зараженным для всех разведений, дающих эффект от 0 до 100%.

Подставляем в аормулу значения, получим

_{ig лд50 = ig ю-² 3 - ig iofJ 4 +1Л + i + i) = -4,5.}

2 1^4   4   4   4   4   4J

Следовательно, в 0,2 мл вируса, разведенного 10^_4>5, содержится одна ЛД₅₀ вируса. Далее рассуждаем так же, как и при расчете по Риду и Менчу. Если lg ЛД₅₀ = -4,5, то ЛД₅р = Ю^-4-⁵, или 1:10^4,5. Значит, в 0,2 мл вируса, разведенного 1:10⁴'⁵, содержится 1 ЛД₅п, а в 0,2 мл исходного вируса содержится таких доз больше в 10⁴'⁵ раза, т.е. 10⁴'⁵ ЛД₅₀. Значит, титр вируса в нашей суспензии Т = 10⁴-⁵ ЛД₅₀/о 2 мл> ^или 1 ЛД₅₀ равна разведению вируса 1:31620.

Титры гемаглютинирующих вирусов можно определить в РГА (см. тему 14).

Титрование антител. При титровании антител иммунных сывороток используют два метода:

1) определение индекса нейтрализации испытуемой сыворотки (см. тему 17);

2) определение максимального разведения испытуемой сыворотки, которое нейтрализует действие стандартной дозы вируса (см. РЗГА, РН и др. реакции).

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо 1. Решить задачи по титрованию вирусов.

Примерный план занятия

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация примера расчета титра вируса в ЭД₅₀ по фактическим данным.

4. Самостоятельная работа студентов по решению задач расчета титра вируса в ЭДдо.

5. Проверка правильности решения задач каждым студентом и исправление выявленных ошибок.

6. Подведение итогов занятия.

7. Задание к следующему занятию.

Методические указания Для занятия по расчету титра вируса в ЭД₅₀ необходимо заранее составить несколько (не менее 10) задач с фактическими данными. Целесообразно составлять задачи с разными тест-объектами и разным инфекционным действием, что способствует закреплению знаний в памяти студентов. Каждую задачу необходимо предварительно решить и иметь готовые ответы, что облегчит проверку.

Расчет разведений можно выполнять как по Керберу, так и по Риду и Менчу.

Вопросы домашнего задания

1. Иммунопрофилактика вирусных инфекций.

2. Сущность и техника постановки РГА.

3. Сущность и техника постановки реакции гемадсорбции.

ГЛАВА 4. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

ЗАНЯТИЕ 14. Диагностические реакции

Цель занятия: изучить сущность и технику постановки реакции гемагглютинации (РГА) и гемадсорбции (РГАд).

Оборудование и материалы: вирус Ньюкаслской болезни (вакцинный штамм), физиологический раствор, 1%-ная суспензия эритроцитов кур, пластиковые панели с лунками, пипетки градуированные на 1 мл (дозаторы пипеточные), резиновые груши, сосуд с дезинфицирующим раствором, не инфицированная и инфицированная вирусом Ньюкаслской болезнью культура клеток в пробирках.

Краткие теоретические сведения

В вирусологической практике широко применяются реакции, основанные на индикации вирусных гемагглютининов. Они получили название диагностических и основаны на способности вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов, вызывая их склеивание. Это реакции гемагглютинации и гемадсорбции. Реакция гемагглютинации (от греч. haemo — кровь и лат. agglutio — склеивать) — реакция склеивания эритроцитов (РГА).

В 1941 г. Херст и независимо от него Мак Клиленд и Хейр показали, что вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур. Впоследствии это явление было подтверждено во многих лабораториях. РГА широко используется в вирусологической практике как быстрый, технически простой и надёжный метод для обнаружения гемагглютинирующих вирусов в исследуемом вируссодержащим материале, а также для титрования вирусных гемагглютининов.

\fРГА неспецифична. Механизм реакции состоит в адсорбции вируса на поверхности эритроцитов в результате физико-химического процесса, зависящего от разности зарядов и других сил межмолекулярного притяжения. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок. Гемагглютинацию эритроцитов вызывают вирусы, содержащие антиген гемагглютинин.

Агглютинация эритроцитов — явление, состоящее из трех фаз. В первой происходит адсорбция вируса на эритроцитах. Затем во второй фазе — агглютинация эритроцитов с адсорбированным вирусом. Может наступить и третья фаза — элюции (освобождения) вируса от эритроцитов.

Факторы, влияющие на РГА многочисленны. Основные из них приводятся ниже.

Штаммы вирусов. Гемагглютинирующая активность штаммов   вирусов   неодинакова   и   варьирует.   У   одних   серотипов энтеровирусов все штаммы способны агглютинировать эритроциты, тогда как у других серотипов того же вируса не все штаммы обладают этим свойством.

Каждый из гемагглютинирующих вирусов способен агглютинировать эритроциты животных только определенных видов и в определенном диапазоне температуры и рН среды, что иногда используется при дифференциальной диагностике. Так, эритроциты лошади и кошки агглютинируются вирусом классической чумы птиц и не агглютинируются вирусом Ньюкаслской болезни; владивостокские штаммы вируса Сендай, в отличие от японских штаммов, не агглютинируют эритроциты овцы при температуре 22 °С и 37 °С, а лишь при 4 °С; вирус западного американского энцефаломиелита лошадей агглютинирует гусиные эритроциты при рН 6,0...6,2, тогда как вирус Западного Нила — при рН 6,8.

Клетка-хозяин. Известно, что в ряде случаев способность вируса агглютинировать эритроциты зависит от хозяина, в котором он размножался. Этот эффект может не зависеть от титра вируса или образования ингибиторов гемагглютинации, хотя очевидно, что определенную роль могут играть и эти факторы.

К числу других факторов, которые влияют на гемагглюти-нацию, относятся доза вируса, используемая при заражении животного, куриного эмбриона или культуры клеток, температура, при которой культуру инкубируют, метод заражения и др.

Видовая принадлежность эритроцитов, используемых в РГА, имеет важное значение для реакции. Некоторые вирусы способны агглютинировать эритроциты животных многих видов. В тоже время известны вирусы, агглютинирующие эритроциты животных только одного какого-нибудь вида. В ряде случаев вирусы вызывают агглютинацию эритроцитов животных только тех видов, которые чувствительны к заражению данным вирусом, или клетки которых можно заразить данным вирусом in vitro. В других случаях такую корреляцию обнаружить не удается. Обычно вирусы, относящиеся к одной классификационной группе, способны агглютинировать эритроциты животных, принадлежащих к одному и тому же виду. По вполне понятным причинам в РГА наиболее широко используют эритроциты домашних птиц и млекопитающих.