Правила работы в вирусологической лаборатории

Рис.43. Внутривенное заражение мыши

Рис.44. Внутривенное заражение кролика

Рис.46. Заражение мыши в нос

Рис.45. Введение материала в сердце морской свинки

Интраназальное заражение: стерильной пипеткой в носовое отверстие вносят каплю исследуемого материала, которую животные при вдохе аспирируют в легкие. Материал не должен содержать высокодисперсных частиц. Наркоз должен быть глубоким, в противном случае у животного возникает чихательный рефлекс и материалом инфицируется окружающая среда. Дозы: для мышей— 0,03...0,05 мл, крыс— 0,05...0,1 мл, морских свинок и кроликов — до 2 мл (рис.46).

Внутримозговое заражение: мышей и крыс заражают как под наркозом, так и без него. Введение вируссодержащего материала осуществляют на расстоянии 1...2 мм от точки пересечения средней линии черепа с линией, соединяющей углы глаз. Место укола дезинфицируют раствором йода или спиртом. Используют туберкулиновый шприц с тонкой иглой, на которую надета резиновая муфта так, чтобы срез иглы был целиком открыт. Мышь фиксируют левой рукой, оттягивая кожу к затылку. Материал вводят постепенно в дозе: для мышей—   0,025...0,03 мл,   для

„    ._ „ крыс — 0,05...0,1 мл (рис.47). Рис.47. Внутримозговое ту„

„„„„______' „ Кроликов и морских свинок

заражение белых мышеи *

Рис.48. Трепанация черепа для внутримозгового заражения кролика

апражают путем прокола кости в области подглазничной борозды. Кожу при этом смещают от середины к борозде, чтобы она после инъекции, приняв естественное положение, закрыла отверстие в «юрепе. Иглу при инъекции держат наклонно по отношению к сфсдней линии, исключая тем самым попадание ее в глазницу. Доза материала 0,3...0,5 мл (рис.48).

После заражения животные должны быть помещены в клетки, на которые навешивают этикетки с указанием вируса или номера экспертизы, количества зараженных животных, даты заражения. В рабочем журнале записывают номер экспертизы исследуемого материала, количество и характеристику зараженных животных, их маркировку, метод введения и дозу вируса. За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внешний лид, подвижность, прием пищи и т.п. Следует отметить, что гибель животных в первые дни после заражения может быть связана с травмой или токсическим действием исследуемого материала.

В последующие за заражением дни ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. Так, при размножении вируса в клетках респираторного тракта наблюдаются кашель, хрипы, одышка, при размножении вируса в клетках мозга — судороги, парезы, параличи и т.д. Однако, клинические признаки большей частью носят неспецифический характер и на этом этапе исследований нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболевание. Для этого необходимо провести идентификацию обнаруженного вируса с помощью различных серологических реакций.

Вскрытие лабораторных животных. Трупы животных, павших от экспериментальной инфекции, немедленно вскрывают и проводят патологоанатомическое исследование. Если зараженное животное не погибло, его убивают в момент максимального проявления симптомов болезни или, при их отсутствии, на 8... 10 день после заражения. Убить животное рекомендуют избыточной дозой наркоза, а также путем разрыва спинного мозга.

Для вскрытия необходимо применять только стерильные инструменты: скальпели, прямые и изогнутые ножницы, ножницы для костей; пинцеты, пастеровские пипетки. Инструменты подбираются так и в таком количестве, чтобы в процессе вскрытия их можно было часто менять. Основной принцип при вскрытии — к трупу животного можно прикасаться только инструментами

или защищенными руками. Мелких лабораторных животных (мыши, крысы, морские свинки, цыплята) при этом прикалывают иголками в распростертом виде к доске или кювете с парафином, покрытыми клеенкой. Можно использовать специальные столики (рис.49), снабженные соответствующими фиксирующими приспособлениями. Они должны быть прикрыты клеенкой и установлены в больших кюветах. Рис.49. Специальный столик ^ПеР^еД вскрытием труп жи-

для мышей, крыс и морских свинок,   вотного дезинфицируют: мел-Передвижной держатель фиксирует    ких животных погружают в голову трупа животного, четыре      2,5% -ный раствор фенола на зажима фиксируют конечности       10... 15 мин, крупных — опрыскивают дезраствором. Вскрытие проводят со строгими соблюдением асептики и личной профилактики. Разрез кожи делают по белой линии живота. Кожу препарируют и оттягивают в стороны. Коленные складки и подмышечные ямки обнажают для исследования лимфатических узлов. После этого труп животного дезинфицируют повторно, меняют инструменты и вскрывают брюшную и грудную полости. Разрез делают так, чтобы не повредить желудок и кишечник. Затем удаляют мышцы живота и брюшину, обнажая при этом сердце, почки, печень, селезенку и снова меняют инструменты (рис.50).

В зависимости от заболевания у трупа асептически берут патматериал. Чаще всего это кусочки паренхиматозных органов, кровь, ткани головного и спинного мозга, различные транссудаты и экссудаты, моча и др. Материал помещают в стерильную посуду и замораживают. В обязательном порядке проводится посев его на сахарные МПА и МПБ в целях исключения бактериальной флоры.

После вскрытия и взятия материала труп, остатки корма, подстилку подвергают автоклавированию или сжигают.

Методы получения различных компонентов крови у животных.

Взятие крови у мышей проводят после их наркоза. Для этого используют пол-литровую стеклянную банку с крышкой, в которую кладут клочок ваты, вливают небольшое количество эфира для наркоза, помещают туда мышь и закрывают крышкой. Наркоз продолжают до тех пор, пока мышь потеряет способность удерживаться на ногах. Затем препаравальными иглами ее прикалывают к доске брюшком вверх, дезинфицируют поверхность

Рис.50. Порядок вскрытия трупа лабораторного животного

живота раствором карболовой кислоты и делают продольный разрез. Отпрепаровывают кожу, создавая емкость, возле передней лопатки. Стерильными глазными ножницами перерезают сосуды под лопаткой. Кровь вытекает в емкость, образованную складкой кожи, ее отсасывают стерильной пипеткой и переносят в небольшую пробирку. Таким образом можно получить 0.5...1 мл крови.

Взятие крови у морских свинок. На край уха свинки скальпелем наносят насечки или прокалывают ступни. Для предупреждения быстрого свертывания крови ушную раковину покрывают тонким слоем парафина. Так удается получить небольшое количество крови.

Кровь у морских свинок берут также и пункцией сердца. Животное при этом фиксируют животом вверх. Место введения иглы — область второго межреберья, 1 ...1,5 см от конца мечевидного отростка. На этом месте удаляют шерсть и дезинфицируют кожу; отступая от левого края грудины на 2 мм, вертикальным уколом прокалывают грудную клетку. Если игла попала в полость желудочка сердца, то кровь поступает в шприц (10 мл). Из сердца у крупных свинок можно получить 10...12 мл крови. После взятия крови морской свинке необходимо ввести такой же объем физиологического раствора.

Взятие крови у кролика можно проводить из надреза наружной вены уха. Для этого выщипывают шерсть в районе прохождения сосуда и поверхность уха смазывают ксилолом. Лезвием бритвы или скальпелем делают надрез вены. Таким путем можно получить до 30...35 мл крови. После взятия крови животному вводят подкожно физиологический раствор, по объему в 2 раза превышающий объем взятой крови.

Получение сыворотки. Кровь после взятия около часа выдерживают в теплом месте (30...35 °С), затем сгусток ее обводят металлической или стеклянной палочкой (отделение сгустка от стенок сосуда) и ставят на ночь в холодильник. Сыворотку отсасывают пипеткой с помощью груши, переносят в стерильный сосуд, фильтруют через асбестовые фильтры "СФ" и консервируют (метриолят натрия, тимол, азид натрия и др.).

Получение эритроцитов. Вначале готовят дефибринирован-ную кровь. Для этого в стерилизованную сухим паром толстостенную банку со стеклянными бусами берут кровь и постоянно встряхивают, не давая ей свернуться. По окончании кровопускания банку с бусами продолжают встряхивать еще 10 мин. Полученную таким образом дефибринированную кровь фильтруют через 2 слоя марли в центрифужные пробирки, центрифугируют 10...15 мин при 1500...2000 об/мин, плазму крови отсасывают пипеткой, к осадку эритроцитов доливают физиологический раствор, хорошо все перемешивают и снова центрифугируют. Эритроциты от сыворотки отмывают не менее трех раз до получения прозрачной надосадочной жидкости и до использования сохраняют в холодильнике (3...5 дней).

Дополнительно в качестве стабилизирующих растворов от предотвращения свертывания крови можно использовать три-лон Б, лимоннокислый натрий, гепарин и др.

Получение взвеси лейкоцитов. Кровь берут в стеклянную пробирку, в которую предварительно наливают 5%-ный раствор трилона Б из расчета 8 капель на 10 мл крови. Кровь хорошенько перемешивают. Затем отбирают 3 мл крови с антикоагулянтом и добавляют к ней цитратный гемостабилизатор (тринатрий цитрат— 13,2 г, лимонная кислота— 4,8 г, глюкоза— 5,0 г, дистиллированная вода до 1 л) в количестве 1/7 объема, т.е. 0,4 мл. Этим добиваются подкисления крови до рН 6,5 для предотвращения агрегации лейкоцитов с тромбоцитами и гранулоци-тами.

Для удаления эритроцитов кровь обрабатывают гипотоническими растворами. Хорошие результаты дает 0,83-0,84%-ный раствор хлористого аммония, способный лизировать эритроциты, не разрушая лейкоциты. Раствор готовят на трис-НС1-буфере рН 7,6 или дистиллированной воде, фильтруют и добавляют к крови в соотношении 9:1. Лизис эритроцитов наступает в течение 2...3 мин. Более эффективны свежеприготовленные растворы, подогретые до 37 °С. После лизиса эритроцитов суспензию центрифугируют при 500 об/мин в течение 5 мин так, чтобы осели лейкоциты, а тени эритроцитов и комплексы гемоглобина остались в надосадочной жидкости, которую сливают. Лейкоциты отмывают 2 раза раствором Хенкса и используют в дальнейшей работе. В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Отработать методику заражения под кожу (белая мышь, морская свинка), внутривенно (кролик), внутрибрюшинно (белая мышь).

2. Освоить методику вскрытия трупов зараженных лабораторных животных (белая мышь, морская свинка).

3. Освоить методы получения крови и ее компонентов.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация приемов фиксации животных; методов экспериментального заражения кроликов и белых мышей; методов умерщвления лабораторных животных; техники вскрытия трупов лабораторных животных; техники получения крови от лабораторных животных.

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания Из лабораторных животных удобнее использовать кроликов и белых мышей, которые по сравнению с морскими свинками более выносливы, но, в противоположность белым крысам, не агрессивны. Животных используют только для отработки методов 6. Зак. 5269 их экспериментального заражения, применяя стерильный физраствор.

При вскрытии белых мышей их помещают в кювету на слой воска, поверх которого кладут лист бумаги. Прикрепляют труп мыши препаровальными иглами. После вскрытия труп заворачивают в эту же бумагу и переносят в автоклавную.

Вопросы домашнего задания

1. Противоопухолевый иммунитет.

2. Понятие о титре, цель и методы титрования вирусов.

ЗАНЯТИЕ 13. Принципы титрования вирусов и антисывороток

Цель занятия: отработать различные методики титрования вирусов.

Оборудование и материалы: тексты задач по титрованию вирусов для каждого студента.

^ /   Краткие теоретические сведения

При работе с вирусами постоянно возникает необходимость определения его количества в том или ином материале. Без этого невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство вакцин и диагностических препаратов, оценка активности противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и др.

Титр вируса — это концентрация вирусных частиц в единице объема материала. Однако, количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых единицах (объем, масса), поэтому прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности (инфекционные единицы). В практике нашли .применение два типа единиц количества вируса: 1) инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемые вирусами и оцениваемые по единичному эффекту ; 2) инфекционные единицы 50% -го действия вирусов на чувствительные живые объекты.

Определение титра вируса по инфекционным единицам локальных повреждений. Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, известны бляшки (рис.51) в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины (рис.52) — некротические узелки на ХАО куриных эмбрионов. В этих случаях говорят о бляшкообразующих единицах (БОЕ) и ос-пинообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной образовать одну бляшку, а одна ООЕ — одну оспину.

Методика определения сводится к следующему. Точными объемами исследуемого вируссодержащего материала заражают несколько культур клеток в матрасах или куриных эмбрионов на ХАО. Затем подсчитывают количество бляшек в каждом матрасе и количество оспин в каждом курином эмбрионе. Рассчитывают среднее арифметическое. Оно точно равно количеству БОЕ или

Рис.51. Бляшки,        Рис.52. Оспины на ХАО куриного эмбриона, образованные зараженного вирусом оспы коров

вирусом в культуре клеток

00Е вируса. Поскольку объем заражающей дозы точно известен, нетрудно рассчитать, сколько БОЕ или ООЕ приходится на единицу объема вируссодержащего материала. Это и будет титром

вируса в материале.

Например, вируссодержащим материалом в разведении 10^_3 заразили 5 эмбрионов и получили 10, 13, 6, 9 и 10 оспин. Среднее арифметическое суммы составит 9,6. Титр вируса в ООЕ определяют по формуле:

Т = — = —^Ц- = 48000 ООЕ/0,2 мл, Уп    0,2 • 10

где а — среднее количество подсчитанных оспин; V — объем вируссодержащего материала, использованного для заражения; п — степень разведения вируссодержащего материала. Следовательно, исходя из наших расчетов, в 0,2 мл вируссодержащего материала в разведении 10~³ содержится 48000 оспинообразующих единиц.