Правила работы в вирусологической лаборатории

Метод иммунофлуоресценции сочетает в себе специфичность серологических реакций и морфологического метода исследования. Его применяют для:

1) индикации, идентификации вирусов и вирусных антигенов в различных объектах; _v

2) выяснения локализации вирусов при изучении патогенеза инфекции;

3) определения местонахождения нормальных и иммунных глобулинов;

4) уточнения антигенного родства вирусов и др.

Одно из главных преимуществ метода иммунофлуоресценции перед другими серологическими реакциями состоит в том, что при его применении значительно сокращается время и не требуется большой массы антигена. При использовании строго специфических, хорошо оттитрованных сывороток можно весьма точно поставить диагноз.

Различают два основных способа диагностического применения метода иммунофлуоресценции: прямой и непрямой (рис.15). При использовании прямого, или одноступенчатого метода для идентификации различных вирусных антигенов применяют соответствующие флуоресцирующие антитела диагностических сывороток, непосредственно обрабатывая ими препараты из исследуемого материала.

При непрямом, или двухступенчатом, способе антиген вначале обрабатывают гомологичными нефлуоресцирующими антителами (1-ая ступень) затем для обнаружения последних, а вместе с ними и искомого антигена, применяют соответствующую им флуоресцирующую сыворотку против антител-глобулинов животного определенного вида: кролик, бык и т.д. (2-ая ступень). Кроме того, вирусный антиген может быть соединен с антисывороткой и комплементом (1-ая ступень), а затем обработан флуоресцирующей сывороткой против комплемента (2-ая ступень, принцип РСК). Непрямой способ более чувствительный, так как каждое антитело 1-ой ступени, применяемое для выявления антигена, многовалентно и может присоединить к себе несколько флуоресцирующих антител 2-ой ступени. Соответственно повышается и сила свечения искомых антигенов.

В качестве объектов исследования можно использовать препараты-отпечатки и мазки, гистосрезы, культуры клеток и т.д. Предметные стекла должны быть тонкими, чистыми, обезжиренными, бесцветными и не иметь царапин. Для итого их промывают в нейтральных детергентах, прополаскивают в дистиллированной воде и сохраняют в спирте или смеси спирта с эфиром.

Препараты-отпечатки и мазки готовят следующим образом. Патологический материал помещают в металлическую ванночку, прижигают сверху раскаленным металлическим шпателем, вырезают из этого участка стерильным скальпелем небольшой кусочек и поверхностью разреза 2-3 раза прикасаются к предметному стеклу (отпечаток) или проводят по нему (мазок).

Препараты из культур клеток получают на покровных стеклах, предварительно вложенных в пробирки, где развивается клеточный пласт (монослой). Затем их отмывают физиологическим раствором от питательной среды, высушивают и фиксируют. При

Рис.15. Схема методов обработки препаратов флуоресцирующими

антителами

этом выбирают такой фиксатор, который не приводит к растворению вирусных антигенов и не нарушает их иммунологической специфичности. Чаще всего для этих целей применяют чистый ацетон, охлажденный до -(10... 15) °С, метиловый или этиловый спирт. Фиксируют препараты 10...15 мин. В таком состоянии их

можно хранить долго.

При использовании прямого метода на препарат наносят 1-2 капли антивирусной флуоресцирующей сыворотки в рабочем разведении. Продолжительность окрашивания — 30 мин. Для предупреждения  высыхания  препараты  помещают  в  большие

чашки Петри с ватными тампонами, смоченными водой (влажная камера). Затем их тщательно промывают физраствором, можно водопроводной водой. Препараты подсушивают и микроскопируют.

При применении непрямого метода препарат вначале обрабатывают 30 мин во влажной камере антивирусной специфической сывороткой. Сыворотку смывают водопроводной водой. На подсушенные препараты наносят на 30 мин флуоресцирующую сыворотку против глобулинов того вида животных (кролика, быка, лошади и т.д.), на которых получена специфическая сыворотка против данного антигена. Затем препараты промывают, подсушивают и микроскопируют.

При обработке препаратов с применением комплемента (2-ой вариант непрямого метода) вначале наносят смесь нефлуоресци-рующей сыворотки с комплементом, а потом — антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку. Для каждого этапа предусмотрена 20...30 минутная экспозиция во влажной камере, помещенной в термостат. Препараты хорошо промывают, высушивают и просматривают под микроскопом (рис 16, 17).

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Ознакомиться с набором флуоресцирующих сывороток и наставлениями по их применению.

2. Обработать препараты прямым методом иммунофлуоресценции.

3. Просмотреть приготовленные препараты в микроскопе и зарисовать в тетрадь.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Самостоятельная работа студентов: а) демонстрация набора флуоресцирующих сывороток; б) положительных препаратов Ауески, ПГ-3 и др.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

При проведении занятия в качестве материала для приготовления препаратов можно использовать любой, полученный от животных, куриных эмбрионов или культур клеток, инфицированных вирусом, с которым работают сотрудники кафедры.

При отсутствии таких возможностей можно пользоваться живыми вакцинами, которыми заражают культуру клеток. Флюоресцирующие сыворотки к возбудителям болезни можно найти в диагностических наборах, выпускаемых биопромышленностью.

С учетом дефицита отведенного времени демонстрацию и объяснения преподавателя можно совмещать с периодом окрашивания препаратов (20...30 мин).

Вопросы домашнего задания

1. Общая характеристика и биологические особенности он-когоиных вирусов.

2. Принципиальная схема устройства электронного микроскопа.

3. Техника приготовления препаратов для электронной микроскопии.

ЗАНЯТИЕ 6. Электронная микроскопия вирусов

Цель занятия: ознакомиться с устройством и основными принципами работы электронного микроскопа, техникой приго-•ионления препаратов для электронно-микроскопического исследо-мшгия.

Оборудование и материалы: электронный микроскоп, ме-тиллическая сетка (100 ячеек в 1 мм²), приспособления, необходимые для изготовления сеток-объектодержателей (станочки для выравнивания металлической сетки, подготовки сеток-объектодержателей требуемой формы и т.д.), формвар (поливи-ни л формальдегид), дихлорэтан, пастеровское пипетки, глазной пинцет, чашка-сливалка небольшого размера, чашки Петри, колба с дистиллированной водой, фильтровальная бумага, вируссо-доржащий материал, альбомы с микрофотографиями различных лирусов, таблицы, диапозитивы.

Краткие теоретические сведения

Электронная микроскопия — один из важных методов индикации и идентификации вирусов и диагностики вирусных инфекций. Важное преимущество этого метода перед другими — быстрота получения ответа и возможность дифференциации вирусов по их морфологии.

Предпосылкой для конструирования электронного микроскопа явилось установление возможности использования вместо света потока электронов. Кроме того, было выяснено, что магнитные поля с осевой симметрией, являясь для потока электронов фокусирующими, действуют как настоящие линзы в обычном световом микроскопе. Это и дало возможность получить изображение объектов при использовании потока электронов. Первый электронный микроскоп был сконструирован в Германии в 1932 г. М.Кнолем и Э.Руска. В нашей стране электронные микроскопы начали создавать в 1937 г. В 1939-1947 г.г. появились их первые заводские образцы, изготовленные с учетом исследований С.Л.Пупко, Н.Г.Сушкина, М.Лебедева.

Электронная микроскопия позволяет непосредственно (визуально) выявлять вирусные частицы в различных материалах, дифференцировать их по форме, размеру и ультраструктуре.

Одна из основных характеристик различных микроскопов — их разрешающая способность. Это наименьшее расстояние между двумя объектами, которые воспринимаются

глазом раздельно. Величина эта математически выражается следующим образом:

0,61 • X

а — ,

п ■ sma

где d — расстояние; X — длина волны; п — показатель преломления среды между линзой и объективом, a — угол половины апертуры объектива линзы.

Если вместо символов поставить их числовые значения, то для светового микроскопа получим d = 2 мкм. Как видно из формулы, только уменьшение длины волны может существенно увеличить разрешающую способность микроскопа, так как другие величины изменяются лишь в небольших пределах. Известно, что пучок электронов обладает волновыми свойствами, а длина волны — переменная величина, зависящая от ускоряющего напряжения. Известно также, что электронным пучком можно управлять с помощью магнитного поля. Эти факты и легли в основу конструкции электронного микроскопа, разрешающая способность которых к настоящему времени достигла 0,1...0,2 нм.

Схематически электронный микроскоп (рис.18) может быть изображен в виде металлического цилиндра, в котором создан вакуум. В этом цилиндре (колонна микроскопа) последовательно сверху вниз расположены вольфрамовая нить (катод), металлическая пластина с отверстием посередине (анод), ряд магнитных линз, между которыми находится держатель объекта, люминес-цирующий экран и фотографическая пластинка. Магнитные линзы представляют собой катушки, содержащие несколько тысяч витков проволоки, через которые пропускают ток. Проходящий через катушку ток создает концентрическое магнитное поле, с помощью которого фокусируется электронный пучок.

Ток в несколько сот мкА, проходящий через вольфрамовую нить, нагревает ее, и атомы металла испускают электроны (эмиссия электронов), которые стремятся сконцентрироваться на вершине нити, образуя электронное облачко. Высокое отрицательное напряжение, приложенное к нити, обусловливает большую разность потенциалов, возникающую между ней и заземленной пластиной анода. Она и ускоряет движение электронов по на-Рис.18. Электронный правлению      к      аноду.       Часть

микроскоп (внешний вид)

электронов проходит через отверстие в его центре (центральная апертура) и образует электронный пучок, направляющийся вниз но колонне микроскопа. Электронный пучок, сфокусированный первой магнитной линзой (конденсорной), освещает объект.

Когда объект введен в колонну микроскопа, он оказывается на пути электронного пучка. При этом происходит взаимодействие электронов с объектом, часть их будет рассеиваться тяжелыми атомами объекта и выбиваться из общего электронного пучка. Нолыпая часть электронов пройдет через объект без отклонения и мызовет свечение люминесцентного экрана в точках попадания электронов. Совокупность темных и светлых точек на экране создает изображение.

Если ввести в колонну микроскопа необработанные вирусные частицы, то на экране появятся лишь размытые пятна. Контрастирование достигается в том случае, когда близлежащие области в исследуемом объекте обладают хорошо выраженной разностью электронных плотностей. Поскольку биологические объ-окты состоят из веществ с малым атомным номером (водорода, углерода, азота, кислорода и др.), то разность их электронных плотностей недостаточна для получения удовлетворительного изображения, при исследовании таких объектов приходиться искусственно повышать их электронную плотность. В этом и состоит одна из процедур подготовки образца для исследования его в электронном микроскопе.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии сводится к следующему:

1) используют специальные медные диски, сетки или бленды;

2) покрывают их пленками-подложками;

3) наносят исследуемый вируссодержащий материал;

4) контрастируют его;

5) просматривают под микроскопом.

Для различных целей могут быть использованы пленки, характеристики которых приведены в табл.1.

Таблица 1

Характеристика пленок-подложек, используемых в электронной

микроскопии

Тип пленки	Прозрачность	Механическая прочность	Стойкость к электронной бомбардировке	Химическая стойкость
Коллодиевая	большая	низкая	низкая	низкая
Формваровая	большая	низкая	низкая	низкая
Угольная	средняя	высокая	очень высокая	очень высокая
Кварцевая	малая	средняя	средняя	высокая

Для получения пленок с требуемыми характеристиками могут быть использованы их комбинации (например, коллодиевая пленка укрепляется углем).

Приготовление пленок-подложек из коллодия. Для изготовления пленки необходимо приготовить 10...15 мл 0,5...2% -ного раствора коллодия в амилацетате. Для этого может быть использован амиловый или изоамиловй эфир уксусной кислоты. Следует помнить, что амилацетат обладает наркотическим действием и работать с ним следует в хорошо проветриваемом помещении. От концентрации раствора будет зависеть толщина пленки. Хранить

его необходимо в темном месте в сосуде с притертой крышкой. Срок годности до 6 мес.

Готовят пленки в следующей последовательности: заполнить воронку водой; поместить под воду стеклянный фильтр; на фильтр положить кусок фильтровальной бумаги; на бумаге разложить сеточки; на поверхность воды пипеткой нанести одну каплю раствора коллодия (во время образования пленки на поверхность воды не дышать), через 2...3 мин после того, как растворитель улетучился, на поверхности образуется различимая глазом пленка. Первые две-три пленки следует удалить стеклянной палочкой. После получения последующей пленки нужно открыть кран и спустить воду. Сеточки с осевшей на них пленкой извлекают вместе с фильтровальной бумагой, высушивают на воздухе и хранят в чашке Петри (рис.19).

Рис.19. Устройство для приготовления пленок-подложек из коллодия: 1 — воронка с водой; 2 — стеклянный фильтр;

3 — фильтровальная бумага;

4 — сеточка для электронной

микроскопии; 5 — поверхность воды; 6 — пипетка для нанесения