Правила работы в вирусологической лаборатории

В вирусологической практике наиболее широко применяют однослойные культуры клеток. Последние, в зависимости от исходного материала, подразделяют на первичные (получают непосредственно из органов животных и человека) и перевиваемые (адаптируют первичные культуры к условиям жизни в пробирке). Их получают путем обработки кусочков тканей ферментами (трипсин). Последние распадаются на клетки, которыми выращивают в виде одного слоя (монослоя) на внутренней поверхности стекла.

Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовали следующие обстоятельства: открытие антибиотиков, предотвращающих бактериальное заражение культур клеток, открытие Эндерсом (1949) способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (ЦПД) — удобный метод индикации вирусов в культуре клеток и, наконец, Дульбекко и Фогт (1952) предложили методику трипсинизации тканей и получение однослойных культур клеток.

В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток.

1. Первичные. Их готовят непосредственно перед применением (для длительного культивирования они не пригодны). Их можно получить из различных органов и тканей человека и животных. Однако, лучше это удается сделать из эмбриональных органов. Чаще всего используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных. После соответствующий подготовки их измельчают на кусочки размером 1...2 мм и обрабатывают трипсином (такие культуры называют первично-ч'риисинизированными). Затем полученную взвесь клеток разли-IIIпот по пробиркам или в другую посуду, заливают питательной еродой, инкубируют в термостате и получают монослой клеток. Обычно он формируется через 3...5 дней. Скорость формирования шншсит от вида ткани, возраста животного, качества питательной сроды, посевной концентрации клеток и других факторов. Пита-•гольную среду меняют по мере ее загрязнения продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в точение 7...21 дня.

Из первичных клеток можно получить субкультуры путем снятия их со стекла раствором версена (или смесью версена и трипсина) и ресуспендирования в новой питательной среде. Суб-культуры получают от 2-5 пассажей и очень редко до 8-10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели.

2. Перевиваемые. Это клетки, способные к размножению нпо организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой при ушговии замены питательной среды. Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Эта работа проводится в течение многих месяцев. I [олагают, что механизм происхождения перевиваемых клеток — розультат их генетической изменчивости.

Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, готероплоидный набор хромосом (у первичных культур он диплоидный), стабильны в условиях роста в пробирке, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает их использование при производстве вакцин.

Перевиваемые клетки можно получить как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Примеры таких клеток: ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); HeLa — (раковая опухоль шейки матки женщины); Нер-2 (карцинома гортани человека); Hep -3 (лимфоидная карцинома человека) и др.

3. Диплоидные. По сути дела это перевиваемые культуры с двойным (правильным) набором хромосом. В первых 50-60 пассажах такие культуры остаются диплоидными и их широко используют для решения ряда теоретических и практических задач биологии (приготовление биопрепаратов для человека, выделение онковирусов и др.). Они весьма жизнеспособны, не подвержены морфологическим изменениям, свободны от спонтанного вирусо-иосительства и т.д.

Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды и соответствующих питательных сред.

Подготовка посуды. Качество посуды имеет важное значение для успешного культивирования клеток вне организма. Луч-,7 шей является посуда из боррсиликатяого или натриевого стекла. Однако, обычное стекло"," выпускаемое заводом "Дружная Горка", после определенной обработки также может быть использовано для культивирования клеток. Посуда должна быть чистой, обезжиренной, не обладать токсическим действием, абсолютно стерильной.

Предложено много способов обработки посуды и в каждой лаборатории выбирают наиболее подходящий из них. При культивировании клеток особенно большие требования предъявляют к подготовке и стерилизации посуды, пробок и других материалов. Во многих случаях неправильная их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой дегенерации клеточного монослоя.

При обработке посуды необходимо учитывать высокую чувствительность клеток к токсическому действию солей тяжелых металлов. Одним из обязательных условий успешной работы с клетками является высокое качество воды. Для ополаскивания посуды используют дистиллированную, а лучше бидистиллиро-ванную воду.

Обычно всю посуду, как новую, так и бывшую в употреблении (БУ), помещают в мыльный раствор, а инфицированную — в мыльно-феноловый (1% мыльной эмульсии + 5% фенола) на сутки. Затем посуду моют теплой водой и обрабатывают по следующей методике. Погружают на 3 ч в раствор хромпика (на 1 л концентрированной серной кислоты добавляют 80 г двухромово-кислого калия К₂Сг₂0₇); раствор должен быть желтовато-коричневого цвета, если он приобретает зеленое окрашивание, значит хромовая кислота восстановилась и раствор непригоден для использования. После обработки в хромпике посуду 5 ч промывают в проточной водопроводной воде, ополаскивают в нескольких сменах дистиллированной воды, сушат, монтируют и стерилизуют 1,5...2 ч в сушильном шкафу (170...180 °С). Посуду БУ обрабатывают хромпиком в течение I ч и стерилизуют при аналогичных условиях.

Пипетки после работы собирают в банки с дезинфицирующим раствором и выдерживают в них не менее суток, затем удаляют ватные прокладки, промывают хромпиком, водопроводной и дистиллированной водой, помещают на некоторое время в 96°-ный этиловый спирт, высушивают, монтируют и стерилизуют в сушильном шкафу 1,5...2 ч при 170-180 °С.

Новые резиновые пробки содержат токсические для клеток вещества. Для удаления их моют в теплой воде щетками, пропомпскивают водопроводной водой, кипятят в 2%-ом растворе NaOH п течение 3 мин, снова прополаскивают водопроводной водой, Г> мин кипятят в 1,8%-ном растворе НС1, ополаскивают водопро-нодной водой, три раза дистиллированной, сушат на воздухе, монтируют и стерилизуют в автоклаве 1 ч npnJ),lJLMna_)..__.

Пробки БУ автоклавируют и 1 ч кипятят, моют щетками, прополаскивают водопроводной водой, один раз дистиллированной, кипятят в течение часа в дистиллированной воде, 3 раза прополаскивают в дистиллированной воде, высушивают, монтируют, стерилизуют в автоклаве.

Инструменты кипятят в дистиллированной воде и погружают в стакан со спиртом (стакан должен находиться в боксе). Перед каждой манипуляцией их прожигают на спиртовке.

Солевые растворы. Для культивирования клеток большинство питательных сред готовят на сбалансированном солевом рас-■пюре, для которого необходимы высокоочищенные препараты, тик как следы ряда примесей (свинец, ртуть и другие тяжелые металлы) токсичны для клеток. Солевые растворы готовят на бидистиллированной воде. Они обеспечивают сохранение рН, осмотического давления в клетках, соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ. Лучшими из них являются растворы Хенкса и Эрла. Эти растворы — обязательный компонент любой питательной среды.

Раствор Хенкса: На 1 л бидистиллированной воды берут NaCl — 8,0 г, КС1 — 4,0 г, MgS0₄ ■ 7Н₂0 — 2,0 г, СаС1₂ — 1,4 г, КН₂Р0₄— 0,6 г, глюкозы — 10 г, 0,2%-го фенолрота— 4,0 мл,

Na₂HP0₄ — 0,6 г.

Раствор Эрла: на 1 л бидистиллированной воды добавляют— NaCl — 6,8 г, КС1 — 0,4 г, СаС1₂ — 0,2 г, MgS0₄ — 0,1 г, NaH₂P0₄ —0,125 г, NaHC0₃ — 2,2 г, глюкозы — 1,0 г.

Для определения в солевых растворах и питательных средах концентрации водородных ионов (рН) применяют индикатор феноловый красный (0,002%). Он не оказывает токсического воздействия на клетки и вирусы. При сдвигах рН в щелочную сторону растворы принимают красно-малиновую окраску, в кислую — желтую. При нейтральном значении рН (7,2...7,4) цвет среды оранжево-красный. Для регулирования рН солевых,тствр-ров и питательных сред используют 7,5% -ный раствор биЩ>5о-ната натрия NaHC0₃ и 3%-ный раствор уксусной кислоты СН₃СООН. Эти растворы готовят на бидистиллированной воде, стерилизуют кипячением и хранят в холодильнике при 4...6 °С не более месяца.

Чтобы получить однослойную культуру клеток, применяют протеолитические ферменты, разрушающие цитоплазматические мостики между клетками. К таковым относятся трипсин, панкреатин, папаин и др. Наиболее часто используют трипсин Дифко в виде 0,25%-ного раствора на фосфатном буфере. Хранят его в замороженном состоянии 6...8 месяцев.

При пересеве перевиваемых клеток с целью отделения их от стекла используют версен (натриевая соль этилендиаминтетраук-сусной кислоты). Он оказывает на клетки более легкое действие, чем трипсин. Механизм действия заключается в том, что он вступает в реакцию со стеклом, образуя промежуточное соединение, которое механическим путем отделяет клетки друг от друга.

Питательные среды. Различают искусственные (полусинтетические и синтетические) и естественные питательные среды.

Естественные питательные среды — это биологические жидкости (сыворотка крови, эмбриональный экстракт, асцитиче-ская жидкость, коровья амниотическая жидкость, тканевые экстракты и др.). Питательные среды из естественных компонентов применяют редко, главным образом для выращивания вновь изолированных тканей в начале культивирования и для поддержания очень прихотливых тканей животных.

К полусинтетическим питательным средам относят гемо-гидролизаты, гидролизат лактальбумина, аминопептид и др.

Лучшей искусственной питательной средой является синтетическая среда 199. Она содержит 60 компонентов: 10 аминокислот, 17 витаминов, 8 минеральных солей, 10 компонент-ов, входящих в состав нуклеиновых кислот и др.

Кроме того, среды подразделяются на ростовые и поддерживающие. Ростовые применяются в 1-ой фазе культивирования клеток. Они богаты питательными веществами и способствуют активному размножению клеток (например, 5%-ый гемогидроли-зат + 10% бычьей сыворотки). Поддерживающие среды применяют во 2-ой фазе культивирования клеток — после зар&жения культуры клеток вирусами. Они поддерживают жизнеспособность клеток. Из поддерживающих сред обычно исключают сыворотку.

Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (50 ЕД/мл), тетрациклин (100 ЕД/мл), устанавливают рН 7,2...7,4; в ростовые среды, кроме того, вносят 10% бычьей сыворотки.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо:

1. Ознакомиться с солевыми растворами и питательными средами, рецептурой их приготовления.

2. Отработать технику подготовки посуды для стерилизации;

3. Провести регулировку рН в одном из растворов, питательной среде (раствор Хенкса, 0,5%-ный гемогидролизат или ДР-).

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация растворов Хенкса, Эрла, трипсина, версе-нп; питательных сред 199, Игла, гидролизаталактальбумина и др.; посуды для культивирования клеток.

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания На занятии необходимо иметь набор солевых и прочих растворов, питательных сред. Очень хорошо демонстрировать фиксированные препараты культур клеток или диапозитивы с последующей их зарисовкой в рабочую тетрадь.

Вопросы домашнего задания

1. Патогенез вирусных инфекций.

2. Получение первично-трипсинизированных культур клеток.

3. Техника подсчета и разлива клеток.

ЗАНЯТИЕ 10. Получение первично-трипсинизированных культур клеток из развивающихся куриных эмбрионов

Цель занятия: ознакомиться с техникой получения пер-Иичных культур клеток методом трипсинизации.

Оборудование и материалы: специально обработанная для выращивания клеток посуда, чашки Петри, колба для трипсини-шщии, центрифужные пробирки, пипетки градуированные на 1,2,5 и 10 мл, стерильные резиновые пробки, раствор Хенкса или Эрла, 0,25%-ный раствор трипсина, питательная среда для культур клеток (ростовая), стерильная сыворотка крупного рогатого скота, пенициллин, стрептомицин, 7,5%-ный раствор соды, 8%-ный раствор уксусной кислоты, центрифуга, магнитная мешалка, стерилизатор со стерильными инструментами (ножницы глазные прямые и изогнутые, пинцеты анатомические), спиртовки, подставки для яиц, сливная чашка, чашка или кювета со льдом, овоскопы или осветители ОИ-19, 2-3 эмбриона 7...10 дневного возраста.

Краткие теоретические сведения

РКЭ вначале овоскопируют, на скорлупе отмечают границу воздушной камеры. Поверхность скорлупы воздушной камеры обрабатывают спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2...3 мм выше границы воздушной камеры, разрывают под скор лупную и хорион-аллантоисную оболочки, асептически извлекают эмбрион и помещают его в чашку Петри. Затем у эмбриона удаляют лапки, крылья, голову и обязательно внутренние органы. Оставшуюся часть (кожно-мышечный мешок) промывают буферным раствором Хенкса с антибиотиками. После трехкратного отмывания эмбрион измельчают ножницами на кусочки размерами 2...3 мм. Измельченную ткань 3 раза отмывают

в растворе Хенкса с антибиотиками от слиз и элементов крови и переносят в колбу дл трипсинизации. Ткань в колбе заливаю двойным объемом 0,25%-ного раствора трипсина, подогретого до 37 °С, и вносят стерильный магнит. Колбу ставят на магнитную мешалку (рис.32). Раствор трипсина и механическое воздействие вращающегося магнита способствуют растворению межклеточного вещества, разделению клеток и переходу отдельных из них в раствор. Первый этап трипсинизации продолжается 3...5 мин. Затем отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные пробирки и помещают в кювету со льдом, чтобы ограничить  дальнейшее  воздействие  трипсина  на