Правила работы в вирусологической лаборатории

Существует два способа введения материала в амнион.

1. Скорлупу над воздушной камерой удаляют и в образовавшемся    окне   глазным   пинцетом   осторожно    отслаивают

1___1,5 см подскорлупной оболочки. Через обнажившийся участок

хорион-аллантоисной оболочки тем же пинцетом делают прокол в направлении к эмбриону в том месте, где нет сосудов. Далее захватывают амниотическую оболочку и осторожно извлекают часть ее наружу через образовавшееся отверстие в хорион-аллантоисной оболочке. В складку амниотической оболочки с помощью шприца вводят вируссодержащий материал в дозе 0,05...0,2 мл. Отверстие в скорлупе закрывают стеклянным колпачком или лейкопластырем, края заливают стерильным парафином. Это так называемый открытый способ (метод окна).

2. В центре воздушной камеры производят прокол скорлупы. Через образовавшееся отверстие иглу шприца вводят на 0,8... 1,2 см ниже границы воздушной камеры. Под легким давлением игла проникает в амниотическую полость, куда и вводят 0,1...0,2 мл материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают стерильным парафином. Это закрытый способ заражения в амниотическую полость.

Заражение в желточный мешок используют для культивирования поксвирусов - вирусов группы оспы, орта- и парамиксо-вирусов (вирусы гриппа, болезни Ньюкасла, возбудитель орнитоза и др.)- Для заражения в желточный мешок пригодны 5...6-дневные эмбрионы.

В скорлупе над воздушней камерой делают прокол, наклоняют яйцо в направлении местонахождения эмбриона и вводят длинную иглу шприца на глубину 2,5...4,5 см от поверхности скорлупы, наклоняя ее в сторону, противоположную эмбриону. Доза вируссодержащего материала 0,2...0,5 мл. Методы заражения РКЭ при диагностике ряда вирусных инфекций представлены в табл.2.

Таблица 2

Использование РКЭ для культивирования некоторых вирусов

Виды вирусов	Возраст куриных эмбрионов, дней	Метод заражения	Применение данного способа заражения для:
				Выделение вируса	Титрации вируса	РГА	РДПА	Рч
Парагриппа-3	8-10	Амнион	+	+	+	+	+
Бешенство	6-7	Желточный мешок	—	+	-	+	+
Осповакцины	12	Хорион- аллантоисная оболочка	+	+		+	+
Герпеса	12	Хорион- аллантоисная оболочка	+	+		+	+
Везикулярного стоматита	7-8	Хорион- аллантоисная оболочка	+	+		+	+
Гриппа, тип А	10	Аллантоис	+	+	+	+	+
Болезни Ньюкасла	10	Аллантоис	+	+	+	+	+
Инфекционного бронхита кур	9-11	Аллантоис	+	+	-	-	+
Инфекционного ларинготрахеита кур	9-12	Хорион- аллантоисная оболочка	+	+		+	+
Гриппа птиц	9-11	Аллантоис	+	+	+	+	-1-

Заражение эмбрионов всегда сопровождают следующие кон-троли: а) на спонтанную возможность заражения. В термостат ставят несколько эмбрионов, с которыми не проводили никаких манипуляций; б) на токсичность материала. РКЭ заражают фильтратом исследуемого патологического материала после унич-

тожсния в нем вирусов автоклавированием; в) контроль жидкости, в которой разводили вируссодержащий материал (раствор Хенкса, физиологический раствор и пр.).

Для исследования вируссодержащего материала и контро-мой используют не менее 4-х эмбрионов (чаще 5-7).

Инфицированные и контрольные эмбрионы помещают в термостат или инкубатор для дальнейшей инкубации при !Ш...37 °С и относительной влажности 60...70%. Эмбрионы ежедневно овоскопируют, погибших помещают в холодильник (4 ...6 °С) на 2...3 ч, а затем вскрывают.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Проовоскопировать 6... 14-дневные РКЭ.

2. Отобрать жизнеспособные и развитые РКЭ.

3. Отметить простым карандашом на скорлупе границу воздушной камеры, местонахождение эмбриона и безеосудистую зо-

4. Заразить РКЭ на хорион-аллантоисную оболочку, в желточный мешок, аллантоисную и амниотическую полости.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация организации рабочего места; овоскопиро-ипния и подготовки куриных эмбрионов, заражения; отработки технических приемов заражения РКЭ всеми способами; строение некрытого эмбриона.

4. Самостоятельная работа студентов: а) овоскопирование двух куриных эмбрионов; б) подготовка к заражению; в) отработка техники заражения всеми методами на одном курином эмбрионе; г) заражение 9-дневного эмбриона вирусом Ньюкаслской болезни (штамм "В" или "Н") в аллантоисную полость, подписы-нание его; д) заражение 11-дневного куриного эмбриона вирусом оспы голубей (кур) на ХАО.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания По теме целесообразно провести два занятия с интервалом в несколько дней с тем, чтобы студенты могли вскрыть зараженные ими эмбрионы. Рекомендуется использовать для заражения вирус Ньюкаслской болезни, штамм "В", который в максимальных титрах накапливается к 5-му дню инкубации, не вызывая гибели эмбриона. Овоскопирование удобнее проводить в затемненной комнате. Студенты работают в марлевых масках, которые после каждой группы стирают и стерилизуют.

Вопросы домашнего задания

1. Взаимодействие вирусов в условиях смешанных инфекций.

2. Методы вскрытия РКЭ, отбор вируссодержащего материала.

3. Получение эмбриональной жидкости для постановки капельной РГА.

4. Патологоанатомические изменения в РКЭ.

5. Цель пассирования вирусов на РКЭ.

ЗАНЯТИЕ 8. Вскрытие куриных эмбрионов

Цель занятия: ознакомиться с техникой вскрытия зараженных куриных эмбрионов, патологоанатомическими изменениями и методикой приготовления эмбрионального экстракта и постановки капельной РГА.

Оборудование и материалы: металлические подставки для куриных эмбрионов, зараженные эмбрионы, физиологический раствор, овоскопы или осветители ОИ-19, стерильные пенициллиновые флаконы и резиновые пробки №14 или 14,5, чашки Петри, глазные ножницы и пинцеты в стаканчиках со спиртом, предметные стекла, 0,5% -ная настойка йода, 5%-ная взвесь эритроцитов кур, пастеровские пипетки, эмалированная кастрюля, вата, спиртовки, таблицы по теме.

Краткие теоретические сведения Куриные эмбрионы при заражении вируссодержащий материалом не всегда погибают, поэтому их следует выдержать определенное время в термостате или в лабораторном инкубаторе (обычно 5... 10 суток, срок зависит от вида вируса). Перед вскрытием их на 2...3 ч помещают в холодильник при 4...6 °С. При охлаждении кровеносные сосуды сокращаются, что предупреждает кровотечение и возможность адсорбции вирусов на эритроцитах в процессе вскрытия эмбриона и отбора вируссодержащего материала. Затем скорлупу в месте воздушной камеры обрабатывают 70%-ным спиртом, обжигают на пламени, снова обрабатывают 0,5%-ной настойкой йода и опять обжигают.

Чтобы получить аллантоисную и амниотическую жидкости, скорлупу стерильными ножницами обрезают на 2...3 мм выше

границы воздушной камеры. Яйцо слегка наклоняют, удаляют оставшуюся подскор-лупную оболочку и через прокол в хорион-

аллантоисной оболочке пастеровской пипеткой, избегая повреждения сосудов, отсасывают 6... 10 мл прозрачной аллантоисной жидкости

(рис.27). После этого пинцетом   захватывают   эмбрион, Рис.27. Выбытие яйца (а) пастеровской  пипеткой  про-

и отсасывание аллантоисной калывают       амниотическую

жидкости (б) . оболочку и  отсасывают  ам-

Рис.28. Вскрытие куриных эмбрионов: а — обрезание скорлупы на границе воздушной камеры; б — отсасывание аллантоисной жидкости; в — извлечение зародыша мистическую жидкость (0,5...1,5 мл). Эмбрион при этом необходимо передвигать, чтобы не закупоривалась пипетка.

Далее ножницами по кругу (граница воздушной камеры) подрезают хорион-аллантоисную оболочку, удаляют этот ее участок и все содержимое эмбриона извлекают в чашку Петри (рис.28). Оставшуюся хорион-аллантоисную оболочку помещают в оторильную чашку Петри, тщательно расправляют и макроскопи-чоски исследуют на темном фоне. Для этого чашку Петри устанавливают на черную бумагу. Затем отделяют эмбрион, разрезают оболочку желточного мешка, освобождают ее от желтка, промы-ишот физиологическим раствором и также помещают в отдельную чашку Петри._

Материал, взятый из куриных эмбрионов, обязательно проверяют на присутствие бактерий путем высева на МПА, МПБ. Следует иметь в виду, что патологоанатомические изменения зависят от вида вирусов и метода заражения РКЭ. Наиболее характерные изменения локализуются на хорион-аллантоисной оболочке: воспалительные очаги — непрозрачные, бело-серого цвета, часто округлой формы; перламутровые бляшки с некротическим центром; кровоизлияния (рис.29).

На теле и голове зародыша, оболочке желточного мешка могут быть кровоизлияния, застойные явления в сосудах лапок и крыльев, в некоторых случаях — отставание в росте ("карликовость", рис.30, 31), скручивание и отечность. Иногда отмечается увеличение печени и кровоизлияния на ее поверхности. Для быстрого обнаружения гемагглютинирующего вируса в исследуемой эмбриональной жидкости (содержимое аллантоисной и амниотической полостей) ставят капельную реакцию гемагглютинации. Для этого  необходимо иметь  5%-ную  взвесь  эритроцитов  кур  на

Рис.29. Узелки на ХАО куриного эмбриона, зараженного вирусом

инфекционного ларинготрахеита птиц

Рис.30. Инфекционный бронхит кур. Карликовость и мумификация зараженных куриных эмбрионов. Посредине вверху незаряженный эмбрион того же возраста

физиологическом растворе, предметное или часовое стекло и пастеровские пипетки.

Техника постановки данной реакции сводится к следующему. На поверхность предметного стекла наносят каплю исследуемой жидкости и каплю 5%-ной 'взвеси эритроцитов кур и перемешивают. В положительном случае реакция наступает через 3...5 мин. Если в жидкости находится гемагглюти-нирующий вирус, то при взаимодействии его с эритроцитами образуется агглютинат (происходит агглютинация эритроцитов), а на-досадочная жидкость становится прозрачной. Если вирус отсутствует или не обладает гемагглюти-нирующими свойствами, эритроциты остаются во взвешенном состоянии, жидкость остается мутной.

При выделении и культивировании вирусов на куриных эмбрионах, как правило, проводят несколько (не менее 3) быстро следующих один за другим пассажей. Это позволяет исключить токсичность исследуемого материала, способствует адаптации вируса, повышению его вирулентности и более интенсивному проявлению патологоанатомических изменений в эмбрионах. Для

Рис.31. Генерализованная оспа на теле куриного эмбриона, зараженного вирусом осповакцины

каждого последующего пассажа используют патологический материал предшествующих, обязательно определяют титр (концентрацию) вируса.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Проовоскопировать зараженные и контрольные РКЭ.

2. Вскрыть РКЭ, собрать вируссодержащий материал, изучить патологоанатомические изменения на теле эмбриона, хорион-аллантоисной оболочке (фиксация в 10%-ном растворе формальдегида), оболочке желточного мешка.

3. Поставить капельную РГА.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация: организации рабочего места для вскрытия эмбриона и получения от него вируссодержащего материала; патологических изменений, капельной РГА.

4. Самостоятельная работа студентов: а) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом Ньюкаслской болезни, отсасывание аллантоисной и амниотической жидкостей, постановка капельной РГА; б) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом оспы, подсчет количества оспин на ХАО.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания Для заражения эмбрионов рекомендуется использовать вирус Ньюкаслской болезни, штамм В, поскольку он накапливается в максимальных титрах к 5 дню инкубации, не вызывая гибель эмбрионов. Содержащийся в аллантоисной жидкости вирус в капельной РГА образует крупные хлопья эритроцитов. Для отработки метода заражения на ХАО удобно использовать вирус оспы голубей, штамм Нью-Джерси. Гибели эмбрионов он не вызывает, но на ХАО образует довольно крупные "оспины". Для пробивания в скорлупе отверстий могут быть изготовлены пробойники из нержавеющей стали. Если их нет, можно использовать инъекционную иглу, вколотую в резиновую пробку. Парафин, предварительно расплавленный, засасывают в пастеровские пипетки, а затем расплавляют на спиртовке, закрывая отверстия в скорлупе. Вопросы домашнего задания

1. Природа и происхождение вирусов. Основные свойства вирусов, отличающие их от бактерий и других микроорганизмов.

2. Виды культур клеток.

3. Культивирование вирусов в культуре клеток.

4. Подготовка лабораторной посуды.

5. Вода, солевые растворы и питательные среды, применяемые в вирусологической практике.

ЗАНЯТИЕ 9. Общие принципы культивирования вирусов в культуре клеток

Цель занятия: ознакомиться с общими сведениями о культурах клеток, солевыми растворами и питательными средами, рецептурой их приготовления, отработать технику подготовки необходимой посуды при получении культуры клеток.

Оборудование и материалы: среда 199, 5%-ный гемогидро-лизат, 0,5%-ный гидролизат лактальбумина, 0,25%-ный раствор трипсина,' раствор Хенкса, 7,5%-ный раствор соды на бидистил-лированной воде, раствор версена, бычья сыворотка и другие среды, смонтированная для стерилизации посуда, пипетки, резиновые пробки, таблицы по теме.

Краткие теоретические сведения

Культура клеток — это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). При этом в пробирках или матрасах образуется клеточный монослой. Культуру клеток практически можно получить из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако, лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как их клетки еще слабо дифференцированы и обладают более высокой потенцией роста.