Правила работы в вирусологической лаборатории

Приготовление сенсибилизированных эритроцитов включает:

а) получение эритроцитов. Для этого используют кровь барана, кре, человека. Кровь, полученную из яремной вены кре или барана, дефибринируют с бусами в течение 20...30 мин и трехкратно отмывают забуференным физраствором. Затем их стабилизи

руют, подвергают танизации и сенсибилизации. В настоящее время чаще применяют эритроциты птиц — кур, индеек, уток. Приготовленные из них диагностикумы быстрее оседают, что позволяет сократить сроки исследования без потери чувствительности;

б) стабилизация эритроцитов. Преимущество стабилизированных эритроцитов в том, что они могут быть заготовлены впрок и длительное время храниться в суспензии, не подвергаясь гемолизу. Для стабилизации эритроцитов предложено много методов. Чаще всего используют формальдегид, глутаровый или акриловый альдегиды. Мы приводим один из методов.

Из осадка отмытых эритроцитов готовят 10%-ную взвесь на забуференном физрастворе рН 7,2. Одновременно готовят 0,2%-ный раствор акролеина на этом же растворителе. Соединяют их в равных объемах и ставят в водяную баню при 37 °С на 30 мин. После стабилизации эритроциты трижды отмывают забу-ференным физраствором и ресуспендируют в этом же растворе до 10% -ной концентрации, разливают по пробиркам и хранят при 2...4 °С. Срок хранения — 1 год;

в) танизация эритроцитов. Механизм действия танина на эритроциты изучен слабо. Но при этом достигается главное — та-низированные эритроциты обладают значительно большей сорб-ционной емкостью.

Фармакопейный танин должен обладать хорошей растворимостью в воде. Хранят его в прохладном сухом месте в сосуде, обернутом в черную бумагу. Раствор танина готовят непосредственно перед опытом. Для этого берут навеску 0,25 г порошкообразного танина и растворяют в 50 мл забуференного физраствора рН 7,2. Получают разведение 1:200, которое является основным и сохраняется на холоде при 2...4 °С в течение месяца. Из основного разведения готовят рабочее (1:20000).

К 5%-ной взвеси акролеинизированных эритроцитов на забуференном физрастворе добавляют равный объем раствора танина в разведении 1:20000. Смесь выдерживают в водяной бане 20...30 мин при 37 °С. В дальнейшем производят отмывание физраствором 2-3 раза и осадок ресуспендируют в физрастворе до 50% -ной концентрации.

Хранят танизированные эритроциты при температуре 2...4 °С. Контроль на их самоагглютинацию ставят через 18...20 ч после приготовления. Для этого в лунке панели смешивают каплю полученной 2%-ной суспензии танизированных эритроцитов и каплю разбавителя. Через два часа эритроциты должны осесть на дно лунки в виде компактной точки. В случае незначительной агглютинации танизированных эритроцитов (4- или ++) суспензию необходимо дополнительно выдержать при 2...4 °С в течение 2...3 суток, после чего повторяют контроль. Если эритроциты и в этом случае оседают в виде "зонтика", то их считают непригодными и готовят заново.

р_ис.57^ Прибор Такачи для постановки серологических реакций

микрометодом: а — перенос компонентов по рядам лунок; б — разлив компонентов специальной пипеткой

г) Сенсибилизация эритроцитов. Для этого используют антисыворотки или антигены. К 0,2 мл 50%-ной суспензии акролеинизированных танизированных эритроцитов на физрастворе добавляют 0,2 мл раствора антигена или антител (концентрация по белку 2 мг/мл) и 0,6 мл физраствора.

К данной смеси приливают по каплям 1 мл 0,1%-ного раствора хрома хлорида и оставляют при комнатной температуре не более, чем на 5 мин. Реакцию останавливают прибавлением 20...50 объемов 0,02 М фосфатно-буферного раствора рН 7,2, для приготовления которого берут 50 мл фосфатного буфера и 325 мл дистиллированной воды. Затем трижды отмывают этим же буфером и хранят в рабочей концентрации (2%-ная взвесь в разбавителе). Для конъюгации можно использовать и другие конъюгирующие агенты (глютаровый альдегид, риванол, ализариновый синий).

Полученные таким образом сенсибилизированные эритроциты используют в РНГА.

Основной опыт РНГА. Реакцию старят в лунках пластмассовых панелей. В последнее время применяют микрометод с помощью прибора Такачи (рис.57). Исследуемые и контрольные сыворотки прогревают 30 мин при 56 "С.

Исследуемые сыворотки крови разводят разбавителем от 1:2 до 1:256. К каждому разведению добавляют каплю эритроцитарно-го диагностикума. Смесь компонентов встряхивают и выдерживают при комнатной температуре. Учет реакции проводят через 2...3 ч, но не раньше полного осаждения эритроцитов в контроле (табл.9).

Одновременно ставят контроли:

1) заведомо положительная сыворотка + эритроцитарный диагностикум;

2) заведомо отрицательная сыворотка + эритроцитарный диагностикум;

3) разбавитель + эритроцитарный диагностикум;

4) учет реакции. Реакцию учитывают по 4-х бальной системе и выражают в плюсах в зависимости от интенсивности агглютинации:

Компоненты	--г         Номера лунок							IVO w^ri"
		1	2 --	3	4	5	6	7	сыворотка положительная		сыво ротка от рица-тель-	1- раз-бави - тель
Разбавитель	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1			ная	0,1
Исследуемая сыворотка	1 0,1	♦ | " 0,1	il 0,1	il 0,1	0,1	♦1 0,1	♦ 1 0,1	0,1 в де. раств	J 5-OD	0,1
Получаемые разведения	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
Эритроцитарный диагностикум	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1		0,1	од
у-    ^позиция Z...3 Ч ПРИ комнятвп» ™„„^„^Н-1-
«у чет ре-зультатов	—|—1—1— +   1	+++ +   1	+++ +   [	+++	+++	++	+	+++ +	-

Титр антител — 1:64

++++ — хорошо выраженный "зонтик" с загибающимися краями;

+++ — "зонтик" с ровными краями;

++ — "зонтик" со слабо выраженным кольцом по краю;

+ — отчетливо выраженное кольцо на фоне слабо выраженного "зонтика";

— — на дне лунки компактная точка эритроцитов.

За титр антител в сыворотке принимают наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию эритроцитов не ниже, чем на ++. В нашем примере (табл.9) титр антител оставляет 1:64. В ходе самостоятельной работы студентов необходимо

1. Подготовить микропанели, петли и пипетки для РНГА.

2. Поставить РНГА с целью определения титра антител в сыворотке.

3. Провести учет результатов реакции.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Демонстрация наборов диагностикумов, выпускаемых биологической промышленностью; методики постановки РНГА микрометодом.

4. Самостоятельная работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания Желательно, чтобы студенты ставили РНГА микрометодом, в качестве компонентов использовать наборы, выпускаемые для этой цели биологической промышленностью. При отсутствии возможности можно ставить РНГА макрометодом с использованием пластмассовых панелей с лунками.

Вопросы домашнего задания

1. Вирусы инфекционного ринотрахеита и диареи крупного рогатого скота.

2. Сущность, схема постановки и учет реакции нейтрализации.

3. Сущность, схема постановки и учет реакции иммунодиф-фузии.

ЗАНЯТИЕ 17. Реакции нейтрализации (РН) 'У    и иммунодиффузии (РИД)

Цель занятия: изучить сущность и технику постановки реакций нейтрализации и иммунодиффузии.

Оборудование и материалы: вируссодержащий ма