Получение гиалуроновой кислоты из микробиологического сырья

3

ЗМІСТ

Вступ

1.Аналітичний ОГЛЯД……………………………………………7

1.1. Хімічна будова і деякі фізико-хімічні властивості ГК……….…7

1.2. Практичне використання ГК…………………………………...10

1.3. Знаходження та біологічні функції ГК у різних мікроорганізмів………………………………………………………….…….13

1.4. Шляхи отримання ГК………………………………………….…14

1.5. Умови та режими культивування штамів-продуцентів ГК……19

1.6. Функції ГК в організмі людини………………………………..…20

1.7. Постановка задачі дослідження…………………………...……..22

2. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА…………………………...….23

2.1. Установки, прилади, лабораторний посуд, реактиви,

матеріали й методики, що використовуються в експерименті………..…..23

2.2. Організація досліджень…………………………………………...24

2.3. Матеріали досліджень ……………………………………………25

2.4. Об’єкти досліджень………………………………………………..26

2.5. Умови культивування штамів…………………………………….26

2.6.Виділення ГК з культуральної рідини штамів…………………...26

2.7. Визначення рН. …………………………………………………....27

3.Обговорення результатів………………………………………….....28

3.1. Пошук штамів-продуцентів ГК серед

непатогенних мікроорганізмів……………………..………………………….28

3.2. Вибір середовища культивування………………………………..29

3.4. Виділення ГК з культурального середовища…...............................30

3.5. Обговорення способу отримання ГК з мікробіологічної

сировини непатогенних мікроорганізмів…………………………………….33

4.ЕКОНОМІЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ

НАУКОВО-ДОСЛІДНОЇ РОБОТИ …………..……………………...……..… 35

5.ОХОРОНА ПРАЦІ І НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА……….47

5.1. Загальні питання охорони праці………………………………..…47

5.2. Організація управління охороною праці при роботах

в хімічній лабораторії кафедри ОС І НТ НТУ «ХПІ»………….…………….48

5.3. Санітарія при проведенні науково-дослідної роботи……….…..52

5.4. Електронебезпека…………………………………………………...55

5.5. Пожежна безпека………………………………………………..…..55

5.6. Охорона навколишнього середовища…………………………….56

Висновки…………..………………………………………………….57

Список використаної літератури…………………………………….....58

ВСТУП

В кінці ХХ - на початку ХХІ століття почалась тенденція до провадження в промисловість різноманітних біопроцесів і до заміни традиційних способів виробництва цілого ряду речовин, які мають медичне, косметичне, кормове або інше призначення, на біотехнологічні способи отримання. Одночасно з цим розкриття функцій і механізмів біологічної дії ряду біополімерів сприяють створенню все нових продуктів і препаратів на їх основі. Одним із таких біополімерів тваринного походження являється гіалуронова кислота (ГК). Прогрес у розумінні біологічних функцій [1] привів і, безумовно, ще приведе до розширення сфер використання даного глікозаміноглікану у складі різноманітних медичних, косметичних, ветеринарних препаратів і подальшому збільшенню попиту на біополімер.   При цьому вже зараз спостерігається певний дефіцит ГК високої і відносно невеликої молекулярної маси, що відображається на високій ціні полісахариду , особливо у порівнянні з аналогічними сполуками рослинного, тваринного або мікробного походження.

Бактеріями, які, як відомо, є продуцентами ГК є Streptococus груп А та С, що є грам-позитивними бактеріями , але ці бактерії , такі наприклад як Streptococcus equi, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis є патогенами , що викликають інфекції у різних типів тварин та людини. Тому актуальною є розробка технології отримання ГК за допомогою промислових непатогенних штамів мікроорганізмів. Це призведе до відсутності у препараті ГК можливих компонентів, які можуть викликати захворювання або алергічні реакції при використанні.

1. Аналітичний огляд

1.1. Хімічна будова і деякі фізико-хімічні властивості ГК

Гіалуронова кислота (ГК) – це природний мукополісахарид (кислий глікозаміноглікан тваринного походження), який  грає дуже велику роль в життєдіяльності організмів. Молекула ГК складається з повторюваних дісахарідних ланок N-ацетил-D-глюкозаміну і глюкуронової кислоти (рис. 1.1). За хімічною природою гіалуронова  кислота - це полісахарид з сімейства глюкозаміногліканів. Вперше вона була виділена Мейєром і Палмером зі склоподібного тіла очей великої рогатої худоби. Лабораторії Мейєра знадобилося майже 20 років для того, щоб встановити точну хімічну будову ГК [10, 11,12].

Рис. 1.1.Структурна формула молекули ГК.

Молекула ГК побудована з регулярно чергуючих залишків D-глюкуронової кислоти і N-ацетил-D-глюкозаміну. Аміноцукор в молекулі ГК з’єднаний з D-глюкуроновою кислотою -(1→4)-глікозидним зв’язком, а глюкуронова кислота з аміноцукором β-(1→3) глікозидним зв’язком [13].

ГК- аморфна речовина білого кольору, яка  розчиняється у воді і не розчиняється в органічних розчинниках. ГК у водному розчині характеризується високим значенням в’язкості. Молекулярна маса залежить від джерела сировини і способу виділення.

ГК - це аніонний (в області фізіологічних значень рН карбоксильна група залишку Е-глюкуронової кислоти майже на 100% депротонована), лінійний (абсолютно нерозгалужений) полісахарид, молекулярна маса якого може відрізнятися в залежності від джерела і методу відокремлення і складає, як правило, 105-107 Да [13,14,15] або до 10 000 і більше дісахарідних залишків, що повторюються. Інші хімічно споріднені ГК глікозаміноглікани, наприклад, хондроітинсульфат, кератансульфат, гепарансульфат мають набагато меншу молекулярну масу і представлені багаточисельними ізомерами в силу наявності сульфітованих груп, кількість і розташування яких в молекулі може істотно варіювати. Тоді як ГК, виділена з різних джерел, завжди хімічно ідентична і відрізняється лише молекулярною масою.

ГК та її солі з лужними металами, магнієм і іоном амонію добре розчиняються у воді і відрізняються властивістю вже в малих концентраціях утворювати високов'язкі водні розчини, а при відносно високих концентраціях (1 – 4 % в залежності від молекулярної маси ГК) утворюються псевдогелі - розчини колосальної в'язкості. Оскільки в розчині молекула ГК при фізіологічних значеннях pH негативно заряджена, то для збереження електронейтральності молекулу в розчині оточують рухомі катіони металів, наприклад  Na+,  К+, Са2+ і  Mg2+. Дана властивість глікозаміноглікану може відігравати важливу роль у функції ГК сполучного матриксу. Солі ГК з важкими металами,  Zn3+,  Zn3+ і т. д.  нерозчинні. Дані іони, будучи введеними в розчин ГК, утворюють поперечні міжмолекулярні зшивки, що призводять до формування міцної гелевої структури з великим вмістом води. ГК також утворює солі, часто не розчинні у воді, з неорганічними і органічними основами, як наприклад, з хлоридом цетилпіридінію, а також метахроматичні комплекси з толуїдиновим синім і іншими фарбниками. ГК специфічно і неспецифічно взаємодіє з різними білками, в результаті чого виходять складні солеподібні комплекси, які характеризуються надзвичайно високою в'язкістю, а іноді випадають в осад [13]. Етерифікування карбоксильних груп ГК метиловим або етиловим ефіром також знижує розчинність ГК.

Середній поздовжній розмір вільного дісахарида становить приблизно 1 нм, тому повна довжина розгорнутої молекули ГК у розчині могла б бути більше 10 мкм, що приблизно дорівнює діаметру еритроцита людини і суттєво перевищує середні розміри бактеріальної клітини. Природно, що молекула ГК приймає у водному розчині більш-менш компактну форму, просторова структура якої в даний час інтенсивно вивчається.

За допомогою рентгеноструктурного аналізу (РСА) ГК та її солей і застосування методів лазерного світлорозсіювання і ядерного магнітного резонансу (ЯМР) при дослідженні розчинів ГК виявлено, що полімер може приймати безліч різноманітних конформацій відповідно до обраних умовами дослідження: іонним оточенням, концентрацією, температурою і т. д. Молекула ГК може згинатися і формувати ліву одинарну і подвійну спіралі або навіть утворювати багатониткові або плоскі структури [16,17,18,19], чому можливо сприяють утворенню водневих зв'язків і виникненню гідрофобних взаємодій.

Додаткові гідродинамічні дослідження розчинів ГК [18] і, конкретно, віскозиметричні вимірювання, проведені в розведених розчинах, показали, що молекула ГК у водно-сольовому розчині набуває структуру у формі статистичного напівжорсткого клубка зі спіральних стрічок і кілець спіральної стрічки [20, 21, 22]. Багаторазово вигинаючись, мов стрічка, спіралізуючись і формуючи більш-менш жорсткий клубок, молекула захоплює велику кількість води і утворює досить великі домени. Внаслідок електростатичного відштовхування між негативно зарядженими групами в молекулі ГК надщільного згортання молекули не відбувається. Дійсна щільність ланцюгів ГК всередині молекулярного доменна невисока - близько 0,1 % мас/об. Це означає, що клубки індивідуальних молекул перехрещують один одного у водних розчинах з концентрацією 1 мг/мл і більше. Таким чином, тільки в дуже розведених розчинах клубки ГК обмежено взаємодіють між собою, зберігаючи відособленість структури, а при підвищенні концентрації через таких накладок, що супроводжується ¬ утворенням міжмолекулярних водневих зв'язків і гідрофобних взаємодій, утворюється міжмолекулярна структура подібна тривимірної комірчастої сітці, яка і відповідає за реологічні властивості біологічних рідин і тканин, наприклад склоподібного тіла ока.

Таким чином, можна зробити висновок, що ГК високої молекулярної маси приймає у водному розчині конформацію напівжорсткого статистичного клубка, усереднена за часом форма якого - сфера, але в кожен окремий момент молекула далека від сферичної форми. Це відбувається в результаті руху сегментів молекули один щодо одного з наносекундним масштабом часу. Динамічна куля молекули ГК вельми нещільна і включає велику кількість молекул води. Вже при вельми невеликих концентраціях ГК конкретні значення яких залежать, насамперед, від молекулярної маси, відбувається міжмолекулярна взаємодія і структурування - формується міжмолекулярна тривимірна комірчаста сітка, яка обумовлює унікальні властивості ГК. Здатність ГК зв'язувати воду можна наочно продемонструвати, якщо взяти 2%-вий розчин ГК у воді. Неважко підрахувати, що в такій суміші міститься 98% води. І все ж вона настільки надійно пов'язана з ГК, що отриману суміш можна взяти в руки, як гель, незважаючи на те, що це - рідина. Навіть 1%-вий розчин ГК має помітну в'язкість, оскільки її молекули утворюють у воді щось на зразок сітки. Недарма ГК називають молекулярної губкою.

1.2. Практичне використання ГК

Дивовижні властивості ГК відразу звернули на себе увагу вчених і лікарів. Уже в 1943 р., через дев'ять років після відкриття, було зроблено спробу використання ГК, виділеної з пуповини новонароджених, у практичній медицині для лікування уражень шкіри. Академік Н.Ф. Гамалея зі співробітниками в 1948 р. заявив препарат "Регенератор". У 1954 р. він був офіційно затверджений Міністерством охорони здоров'я СРСР і рекомендований для використання в клінічній практиці як неспецифічний біостимулюючий і ранозагоювальний та протимікробний засіб [29]. У 1972 р. було зареєстровано препарат "Скловидне тіло", отриманий зі склоподібного тіла ока великої рогатої худоби. Перший високоочищений препарат ГК високої молекулярної маси було отримано з гребенів курей. На світовому ринку препарат представлено під торговою маркою "Healon" (Pharmacia).

Оскільки було доведено [31], що ГК має антимікробну і регенеруючу дії, на її основі було розроблено ефективні препарати для лікування опіків і променевих уражень шкіри. Препарати ГК використовують також для лікування трофічних виразок. ГК має виражену біостимулюючу дію при тривалих незагоюючих трофічних виразках. Можливі механізми дії ГК в даний час обговорюються, проте вже достовірно показано, що низькомолекулярна ГК (менше 10 кДа) має виражену ангіогенну дію (процес утворення нових кровоносних судин в органах чи тканинах, що є пошкодженими) [8, 27]. Підшкірне і місцеве введення ГК запобігає утворенню грануляційних тканин, спайок, рубців, знижує набряклість, запальні явища, свербіж шкіри, нормалізує кровопостачання, сприяє рубцюванню трофічних виразок без будь-яких виражених клінічних ускладнень [31, 32].

Висока вартість ГК довгий час перешкоджала розширенню спектру застосування біополімеру. Тому спочатку ГК знаходила виключно медичне застосування, наприклад в очній хірургії чи лікуванні дегенеративних остеоартритів, де великі витрати на лікування були виправдані. Однак накопичення інформації про унікальні властивості ГК і поступове зниження собівартості, викликане широким впровадженням біотехнологічних способів отримання даної речовини, підштовхують розвиток різноманітних програм, в яких знаходить застосування ГК. Ведуться дослідження по застосуванню ГК в харчовій промисловості. Підставою для включення ГК в біологічно активні добавки (БАД) є її пролонгуючий, противірусний та імуномоделюючий ефекти. Проводяться дослідні роботи зі створення складних комплексів ГК та різноманітних лікарських засобів для можливого застосування і в інших (крім офтальмології) галузях медицини - вірусології, онкології, оториноларингології, хірургії, ендокринології [31].