Получение гиалуроновой кислоты из микробиологического сырья

Як і в інших біологічних системах, в тканинах, які синтезують ГК, нуклеотидні похідні моносахаридів утворюються  за допомогою реакцій, каталізується  так названими пірофосфорилазами; у реакціях цього типу нуклеозидтрифосфат взаємодіє з фосфорнокислими похідними цукрів з утворенням  неорганічного пірофосфату, як наприклад:

УТФ+ глюкозо-1-фосфат        УДФ глюкоза + пірофосфат

                                        УДФ галактоза                  УДФ ідуронова кислота

Глюкозо-1-фосфат            УДФ глюкоза              УДФ глюкуронова кислота

Глюкоза       Фруктозо-6-фосфат

Глюкозаміно-6-фосфат                                                         Гіалуронова

                                                                                                     кислота

Ацетилглюкозаміно-6-фосфат       Ацетилглюко-         УДФ ацетилглюко-                                                                                                                         

                                                          заміно-1-фосфат                  замін

                                                                                            УДФ ацетил-

                                                                                    галактозамін

У схемі біосинтезу ГК видно, як активований у результаті приєднання до нуклеотиду залишок глюкози піддається перетворенню у залишок глюкуронової кислоти. Перетворення глюкози у глікозамін відбувається до з’єднання з нуклеотидом. Залишається неясним механізм заключного етапу біосинтезу: яким чином, у відсутності матриці, досягається чергування у макромолекулярному ланцюгу глікана залишків ацетилглікозаміну і глюкуронової кислоти. Мислимі два варіантів цього процесу:

1) один фермент поступово приєднує до зростаючого полісахаридного ланцюга потрібні моносахаридні залишки;

2) спочатку ( за допомогою одного ферменту) утворюються зв’язані з нуклеотидами (активовані) дісахариди, а потім інший фермент з’єднує дісахариди у полісахарид.

Остаточне рішення цієї альтернативи доки неможливе, але більш вірогідним є перший варіант,оскільки немає даних, котрі говорили б про участь у процесі більше ніж одного ферменту.

1.5.Умови та режими культивування штамів-продуцентів ГК

Бактеріями, які, як відомо, є продуцентами ГК є Streptococus груп А та С, що є грам-позитивними бактеріями , але ці бактерії , такі наприклад як Streptococcus equi, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis є патогенами , що викликають інфекції у різних типів тварин та людини. Ці гемолітичні штами бактерій , що мають здатність до гемолізу кров'яно-агарового середовища. Температура накопичення даних штамів є температура тіла людини або тварин , та знаходиться у межах 37оС. Приймаючи до уваги, те що існують деякі проблеми при роботі та використанні патогенних організмів таких як:

1.Великі витрати на оснащення боксів для груп патогенних мікроорганізмів.

2.Велика небезпека для промислового і лабораторного персоналу.

3.Потенціальна небезпека для населення, яке мешкає неподалік.

4.Витрати на обладнання для безпечного культивування штамів патогенних мікроорганізмів.

5.Витрати на підготовку робітників - інженерів і лаборантів – мікробіологів відповідної кваліфікації.

6.Витрати на сертифікацію лабораторії для роботи з патогенними штамами – мікроорганізмами.

Було вирішено провести дослідження можливості біосинтезу ГК непатогенними штамами – мікроорганізмів:п Leiconostoc mesenteroides, Saccaromicetes cerevisae, Lactobacillus.

1.6.Функціїї ГК в організмі людини

В організмі людини ГК відіграє різноманітні функції. Вона є головним компонентом синовіальної рідини суглобів, яка слугує в якості ”змазки” для суглобних поверхонь кісток, входить до складу хряща. У шкірі ГК наряду з деякими іншими подібними молекулами (протеогліканами), утворює міжклітинну речовину. Шкіра, яка містить значну кількість ГК, прямо-таки насичена водою, що забезпечує її пружність і стійкість до зовнішніх дій. При ушкодженні шкіри сонячними променями («сонячний опік»), у ній розвивається запалення, синтез ГК практично зупиняється, а швидкість розпаду, навпаки, збільшується.

Однією з головних причин старіння шкіри вважається її ушкодження УФ-променями. При фотоушкодженні в клітинах шкіри практично зупиняється синтез ГК і збільшується швидкість її розпаду. Це призводить до формування характерної картини фотостаріння- потовщена,нерівномірно пігментована шкіра з грубими зморшками і складками.

Нормальний водяний баланс дуже важливий для зовнішнього вигляду шкіри. З віком утрата вологи починає переважати над її постачанням, знижується тонус та еластичність шкіри, з’являються зморшки. Синтез ГК з віком також знижується, а руйнування під дією різноманітних зовнішніх і внутрішніх факторів – збільшується. Крім того, при старінні якісний стан ГК стає зовсім іншим, і вона вже не може повноцінно виконувати усі свої функції. Зменшення загального складу вологи у шкіри приводить до того, що вона становиться сухою, дряблою, на ній з’являються  зморшки та складки.

Отже, ГК дуже потрібна організму людини, тому що:

1) ГК- найкращий із відомих зволожуючих агентів для шкіри, який збільшує пружність шкіри. Але звичайно не проникає за межі рогового шару шкіри. Нетоксична.

2) ГК- є головним компонентом, який відповідає за в’язкість синовіальної рідини  у тілі людини.

3) ГК- важливий компонент суглобного хрящу. Її багато у шкірі, кістках, клапанах серця, у яйцеклітинах і з’єднувальних тканинах, де вона бере участь у генерації тканини.

4) ГК- середовище для поживних речовин і продуктів розпаду.

5) ГК, як губка збирає молекули води у шкірі, утримуює їх, заповнюючи зморшки і надає контуру обличчя об’єм.

6) ГК також приймає участь у стимуляції активності колагену і еластину, покращує загоєння, активізує відновлювальні процеси  шкіри.

Причини нестачі ГК в організмі людини:

1) Несприятливий вплив зовнішнього середовища.

2) Вплив електромагнітного поля при використанні комп’ютера, мобільних телефонів, побутових приборів.

3) Погана екологічна обстановка.

4) Низька якість води.

5) Використання продуктів в їжі, насиченими консервантами, барвниками, ГМО та постійні нервові стреси.

1.7. Постановка задачі дослідження

Виходячи з аналітичного огляду, актуальною є розробка технології отримання ГК за допомогою промислових непатогенних штамів мікроорганізмів. Впровадження даної розробки призведе до відсутності у препараті ГК можливих компонентів, які можуть викликати захворювання або алергічні реакції при використанні.

В результаті проведеного аналітичного огляду визначено і обґрунтовано основні задачі дослідження:

1) Пошук та обробка літературних даних, виявлення методів виділення, та очистки ГК;

2) Вибір більш придатних методик, які можливо відпрацювати у лабораторії кафедри.

3) Отримання ГК з мікробіологічної сировини, за допомогою існуючих методів, та спроби вдосконалення методів очистки глюкозаміногліканів від попутних речовин екстракції;

4) За допомогою лабораторних досліджень та використовуючи літературні дані провести екстракцію і очистку ГК від супутніх речовин.

Таким чином, основною метою дослідження є пошук способу одержання ГК з мікробіологічної сировини непатогенних мікроорганізмів.

2. Експериментальна частина

2.1 Установки, прилади, лабораторний посуд, реактиви, матеріали й методики, що використовуються в експерименті

2.1.1 Установки для проведення експерименту

- установка для сублімаційної сушки під вакуумом

- установка для екстракції

- установка для проведення ферментації

2.1.2. Прилади, що використовуються в експерименті

-       центрифуга;

-       ваги аналітичні;

-       рН метр;

-       термометр;

-       водяна баня з електропідігріванням.

2.1.3 Лабораторний посуд, що використовується в експерименті

-         хімічні пробірки

-         мірні циліндри

-         мірні колби

-         стакан хімічний

-         пробірки для центрифугування

-         піпетки

-         скляна паличка

2.1.4 Реактиви та сировина для проведення експерименту

-         дріжджовий екстракт

-         глюкозамін

-         Штам Leiconostoc mesenteroides

-         Штам Lactobacillus

-         Пекарські дріжджі Saccaromicetes cerevisae

-         Карбазол

-         H2SO4 (конц.)

-         Етанол  (C2H5OH)

-         NaCl

-         Ацетон

2.2. Організація досліджень

У відповідності до мети роботи теоретичні та експериментальні дослідження проводилися у декілька етапів. Структурну схему, що відображує послідовність проведення основних етапів дослідження, наведено на рисунку 2.1.

Рис. 2.1. Схема організації досліджень з розробки технології біосинтезу ГК.

2.3. Матеріали досліджень

Матеріалами досліджень є мікробіологічні живильні середовища, на яких відбувається мікробіологічний синтез ГК відповідними штамами.

2.4. Об'єкти досліджень

Об′єктом дослідження є штами Leiconostoc mesenteroides, Saccaromicetes cerevisae, Lactobacillus.

2.5. Умови культивування штамів

У якості середовища, яке спроможне підтримувати рост Leiconostoc mesenteroides, було обрано середовище, яке містить капусний сік з доданням мінеральних солей (Mg2+, К+). Культивування проводилося при доданні глюкозаміну, котрий і слугував субстратом для біосинтезу гіалуронової кислоти. Штами вирощувалися у 100 мл колбах з ватними пробками на качалці 150 об/хв за температури 37° С протягом 48 годин , та потім температуру було знижено до 15° С.

Штам Saccaromicetes cerevisae культивували у водному середовищі з  мінеральними солями(Mg2, К+).  та глюкозаміном у якості єдиного джерела для біосинтезу ГК. Культивування проводили у 100 мл колбах з ватними пробками на качалці 150 об/хв  за температури 15 С.

Штам Lactobacillus культивували також у водному середовищі з додаванням екстракту дріжджів та мінеральними солями(Mg2, К+). Культивування проводили у 100 мл колбах з ватними пробками на качалці 150 об/хв  за температури 15 С.

Концентрація глюкоза міну для біосинтезу ГК у живильних середовищах складала 50.0 г/л, концентрація солей - 2 г/л.

2.6. Виділення ГК з культуральної рідини штамів

Виділення ГК з культурального середовища проводили за власною методикою. Суміш спочатку підігрівали, фільтрували через фільтр та проводили центрифугування фільтрату при 6000 об/хв. протягом 15 хвилин. Наявність полісахариду у культуральному середовищу визначали за допомогою карбазольної реакції Діше, по рожевому забарвленню. Кінцеву концентрацію та динаміку біосинтезу ГК також контролювали  спектрофотометрично за карбазольним методом за допомогою калібрувального графіку. Отриманий осад знову розчиняли у воді та обробляли протеазою – хімотрипсином для гідролізу білку. Далі проводили осадження ГК за допомогою етанолу. Осад висушували  за температури 40° С та зберігали за температури – 18° С.

2.7. Визначення рН

рН культурального середовища визначали за допомогою рН–метру – мілівольтметру 150–МА для вимірювання значень рН, окислювально-відновлювального потенціалу (Eh) та температури.

3. ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

3.1. Пошук штамів-продуцентів ГК серед непатогенних мікроорганізмів

Вибір об'єктів дослідження проводився виходячи з того, що деякі штами можуть синтезувати позаклітинні полісахариди використовуючи відповідні субстрати – моносахариди та дисахариди. Одним з таких штамів є Leiconostoc mesenteroides, що є одним з підвидів молочнокислих бактерій. Нами був обраний даний вид мікроорганізмів з огляду на те, що, імовірно, за певних умов культивування (наявність у складі живильного середовища таких моносахаридів, як глікозамін) Leiconostoc mesenteroides може продукувати ГК.