Получение гиалуроновой кислоты из микробиологического сырья

Також відомо, що деякі штами лактобактерій та дріжджів можуть синтезувати ГК, що і обумовило наш вибір мікроорганізмів Lactobacillus та Saccaromicetes cerevisae як продуцентів ГК.

Було поставлено за мету дослідити можливість використання цими штамами у якості субстрату для біосинтезу полісахариду – ГК глюкозаміну. Позаклітинні полісахариди синтезуються на рівні мембран, а потім виділяються у навколишнє середовище – у культуральну рідину з якої відбувається осадження полісахариду. Як відомо, моносахаридний склад гліканів не змінюється у залежності від джерела вуглецю. Якщо мікроорганізм має змогу до синтезу більше одного екзоглікану, то зміна вуглецевого субстрату, а у нашому випадку це – глікозамін, веде до переважного синтезу такого полісахариду. Глікозамін являє собою моносахарид, що входить до складу гіалуронової кислоти у вигляді N-ацетілглікозаміну.

Leiconostoc mesenteroides також являється основним мікроорганізмом, який синтезує полісахарид - декстран. Декстран – а-D-глюкан, який синтезується різними грампозитивними і грамнегативними бактеріями, такими як Aerobacter spp., Streptococcus bovis і S.viridans, а також Leiconostoc mesenteroides. У промисловості цей полімер отримують вирощуванням Leiconostoc mesenteroides на сахарозі. Більшість полісахаридів являються продуктами внутріклітинного синтезу, проте при утворенні декстрана  субстрат не проникає у клітину. Високомолекулярний  полімер осаджують органічними розчинниками, а потім руйнують ферментативним шляхом за допомогою гідролізу слабкої кислоти або нагріванням до отримання продукту з потрібною молекулярною масою. Ступінь такої деградації контролюється по зміні в’язкості. У якості альтернативи можна використовувати низькомолекулярні полісахариди як «затравку» для отримання декстранів з потрібним ступенем полімеризації. Бактеріальні інокуляти часто неодноразово промивають сольовим розчином для позбавлення домішків високомолекулярних полімерів, які змогли б слугувати  «затравками» при полімеризації. При високій концентрації сахарози (70% по масі) утворюється в основному однорідний набір низькомолекулярних декстранів. При використанні низькомолекулярної декстранової затравки  (10000-25000) і невеликих концентрацій сахарози (10% по масі, рН 5, 15◦С) значна частина отриманого продукту (50%) має молекулярну масу в межах 50000-100000; при цьому відпадає необхідність в його подальшому фракцію ванні  для застосування у медицині.

3.2. Вибір середовищ культивування мікроорганізмів

Середовища культивування підбиралися таким чином, щоб забезпечити потрібний рівень біосинтезу ГК, використовуючи глікозамін у якості основного джерела – субстрату. Аерацію середовища здійснювали за допомогою методу вирощування на качалках. Виходячи з того, що основним елементом є ацетильований глікозамін, ми додавали до середовища натрієву сіль оцтової кислоти – ацетат натрію. Основуючись на тому, що біосинтез ГК не потребує для себе біосинтезу білку, ми не додавали амінокислот у вигляді м’ясо-пептонного бульону. Таким чином, середовище складалося з мінеральних солей та глюкозаміну.

3.4. Виділення ГК з культурального середовища

У ході дослідження ми використовували стандартні методи виділення полісахаридів осадженням етиловим спиртом. Як правило, основною метою очищення ГК є усунення білкових домішок, що спричиняють алергічні реакції. Виходячи з того, що ГК екстрагується з мікробіологічного середовища, потрібна дуже висока чистота препарату та повна відсутність білку у препаратах ГК. Схема отримання ГК з непатогенних мікроорганізмів подана на рисунку 3.1.

Рис. 3.1. Виділення ГК з культуральної рідини методом осадження.

Біомасу відділяли центрифугуванням. У результаті центрифугування було отримано надосадкову рідину – супернатант. Реакція на уронові кислоти у відцентрифугованому осаді біомаси не показала, що він після центрифугування містить ГК і тому осад було відкинуто. Після відділення біомаси була проведена карбазольна реакція Діше, результатом якої є рожеве забарвлення – якісна реакція на уронові кислоти, що вказала на присутність та наявність ГК у культуральному середовищі.

3.4.1. Визначення динаміки біосинтезу ГК у культуральному середовищі

Динаміку біосинтезу ГК та концентрації ГК у культуральному середовищі визначали також спектрофотометнично з використанням методу Діше – карбазольної реакції. Концентрацію визначали за калібрувальним графіком (рис. 3.2), котрий було побудовано використовуючи розчини різних концентрацій комерційного препарату гіалуронової кислоти.

Рис. 3.2. Калібрувальний графік спектрофотометричного визначення ГК.

Зміна вмісту ГК в ході біосинтезу в культуральному середовищі  з Leiconostoc mesenteroides представлено в таблиці 3.1. Судячи з відбору проб кожних 24 години, можна бачити динаміку збільшення концентрації у культуральному середовищі. Як можна бачити кількість синтезованої штамом ГК збільшувалося кожні 24 години на 5 – 6 мкг/л протягом кожних 12 годин.

Таблиця 3.1. Зміна вмісту ГК в ході біосинтезу в культуральному середовищі  з Leiconostoc mesenteroides.

           Було припущено, що перше центрифугування не усунуло повністю залишки білку і таким чином у надосадковій рідині могла міститися деяка кількість не осадженого білку. Після цього проводилося осадження ГК із деякою кількістю білкових речовин , що є потенційними імуногенами та мають бути усунені. Основним методом очищення від білку ми вибрали метод гідролізу протеолітичними препаратами молекул білку, а саме хімотріпсином, за відповідної температури 30 С та рН 6,5. Перевагою цього методу є те  що протеолітичні ферменти є високоспеціфічними та проводять гідроліз виключно білків. До того ж, хімотрипсинізацією можна добитися майже повного гідролізу поліпептидів до мономерів – амінокислот в результаті так званого автолізу – саморозщеплення ферментів – протеаз. Це дозволило нам якомога повніше відокремити білкові залишки від ГК. Після проведення гідролізу проводилося друге центрифугування очищеної ГК. Було отримано білий осад. Реакція Діше показала позитивний результат. Потім осад було висушено.

3.5. Обґрунтування способу отримання ГК з мікробіологічної сировини непатогенних мікроорганізмів.

В результаті проведених досліджень запропоновано технологію отримання препарату ГК з мікробіологічної сировини непатогенних мікроорганізмів, яка представлена на рисунку 3.3.

Рис. 3.3. Технологія отримання препарату ГК з мікробіологічної сировини непатогенних мікроорганізмів.

Як видно з рисунку 3.3, підготовчими етапами отримання препарату ГК з мікробіологічної сировини непатогенних мікроорганізмів є стерилізація обладнання та підготовка поживного середовища для мікроорганізмів разом із засіванням поживного середовища штамом мікроорганізму. Після цього за відповідних умов відбувається процес біосинтезу ГК мікроорганізмом. Наявність і концентрація ГК у живильному середовищі контролюється за допомогою карбазольного методу Діше. По досягненні максимуму концентрації ГК у процесі біосинтезу проводиться температурна інактивація біомаси та відокремлення культуральної рідини центрифугуванням. Далі проводиться осадження етанолом ГК у комплексі з білками з культуральної рідини та гідроліз білків ферментами для відокремлення їх від ГК. На наступному етапі проводиться центрифугування осаду, який містить ГК, з культуральної рідини і відокремлення цього осаду, що представляє собою препарат ГК. Далі препарат висушується під вакуумом за низьких температур (0 оС) і заморожується для зберігання.

4 ЕКОНОМІЧНА ЕФЕКТИВНІСТЬ НАУКОВО-ДОСЛІДНОЇ РОБОТИ. РОЗРАХУНОК СОБІВАРТОСТІ І ЦІНИ НАУКОВО-ТЕХНІЧНОЇ ПРОДУКЦІЇЇ

Витрати, що включаються в собівартість НДР, групуються відповідно до їх економічного змісту за наступними елементами:

- матеріальні витрати;

- витрати на оплату праці;

- відрахування на єдиний внесок;

- амортизація основних фондів і нематеріальних активів;

- інші витрати.

4.1 Визначення матеріальних витрат

До складу матеріальних витрат належать: вартість сировини і матеріалів, покупних виробів і напівфабрикатів, вартість робіт і послуг виробничого характеру, які виконуються сторонніми організаціями, вартість придбаної енергії усіх видів, що витрачається на технологічні потреби, пов’язані з виконанням даної НДР, і інші витрати згідно з [50].

Вартість матеріальних ресурсів щодо «Матеріальних витрат» визначається за ціною їх придбання без врахування податку на додану вартість, комісійних винагород постачальницьким установам і зовнішньокомісійних винагород, вартості послуг товарних бірж, у тому числі брокерських.

У вартість матеріалів включаються витрати, пов’язані з транспортуванням матеріальних ресурсів, у тому числі навантажувально-розвантажувальних робіт, які здійснюються власними силами організації.

Кількість матеріалів, що витрачаються на виконання НДР (Рі), встановлюється виходячи з кількості дослідів, проведених протягом усієї експериментальної частини дипломної роботи і необхідних витрат сировинних компонентів на один дослід.

Розрахунок вартості матеріалів здійснюється за формулою (4.1)

                            См = Ві ·Ці·1.1,                                                     (4.1) 

де Ві – витрата і-го компонента на весь експериментальний обсяг робіт; Ці – вартість і-го компонента, грн../од.; 1.1 – коефіцієнт, що враховує транспортні витрати.

Визначення витрат  на матеріали подано у вигляді таблиці 5.1

Ціни на матеріали встановлюються за каталогами, прайс-листами, даними підприємств, що діють на момент визначення витрат на НДР.

Таблиця 4.1 – Розрахунок витрат на матеріали для виконання НДР

Вартість матеріалів враховуючи транспортні витрати

  См=204.5·1.1=224.95грн

Витрати на електроенергію, пов’язану з технологією проведення НДР, обчислюють за формулою (4.2)

                               Се=Nустj·nj·tj·kп·Це,                                             (4.2)

де Nустj – потужнысть j-го устаткування, кВт; nj – кількість j-го устаткування, шт.; tj – час роботи j-го устаткування, години; kп – коефіцієнт попиту, рівний 0,72; Це – вартість однієї кВт години електроенергії, грн./кВт год., рівна 0,75 грн

Результати розрахунку споживаної електроенергії зведені в таблицю 4.2

Таблиця 4.2 – Споживана електроенергія