Получение гиалуроновой кислоты из микробиологического сырья

Одним з найбільш перспективних напрямків вважається застосування ГК як пролонгатора дії інших біологічно активних речовин (БАР), включених в рецептуру. Високомолекулярна ГК здатна обволікати молекули або частинки БАР з утворенням в'язкого еластичної матриці, з якої препарат поступово вивільняється протягом тривалого часу. Біологічно активні компоненти можуть бути ковалентно або не ковалентно пов'язані з ГК. Міняючи концентрацію ГК, можна контролювати швидкість її деградації або дифузії і, таким чином, швидкість доставки лікарського засобу в тканини [31]. При внутрішньо суглобовому, внутрішньо м'язовому або підшкірному введенні ГК створює депо препарату в місці ін'єкції і, поступово руйнуючись, звільняє ліки.

ГК знаходить все більш широке застосування у виробництві косметичних засобів. Гіалуронова кислота вважається одним з найбільш "приємних" косметичних інгредієнтів. Це білий порошок, який повільно, але повністю розчиняється у воді, утворюючи в'язкий, безбарвний гель вже при концентрації 1%. Цей гель можна зберігати для подальшого використання в косметичних композиціях. Емульсії на основі гіалуронової кислоти мають м’яку і ніжну консистенцію, а крім того, вона прекрасно сумісна зі шкірою і ніколи не викликає подразнення і алергічних реакцій. Якщо б за допомогою косметичних засобів вдавалось заповнити дефіцит гіалуронової кислоти безпосередньо в дермі, це дозволило б зберегти нормальну гідратацію шкіри навіть на фоні зниженого кровопостачання. Однак гіалуронова кислота, що міститься в косметичних кремах, не здатна проникнути навіть в епідерміс, а тим більше досягти дерми. І все ж, не зважаючи на те, що область впливу косметики, яка містить гіалуронову кислоту, обмежена роговим шаром, вона здатна реально зволожувати шкіру і помітно покращувати її зовнішній вигляд.

У порівнянні з іншими поширеними зволожувачами гіалуронова кислота має ряд переваг. Вона має найвищу гігроскопічність (здатність зв'язувати воду) у порівнянні з іншими поширеними зволожуючими агентами, такими, як гліцерин та сорбітол. При цьому, на відміну від гліцерину, вона зберігає свою активність в сухій атмосфері. Таку властивість можна назвати "ефектом памперса" - поглинена вода утримується всередині у вигляді гелю і не випаровується навіть при зниженні відносної вологості навколишнього повітря. Ця дуже корисна характеристика знайшла застосування у медицині при лікуванні ран. Виявляється, для того, що б рана заживала без рубця, її, треба підтримувати в стані постійної вологості. Вологе стерильне середовище дозволяє клітинам вільно пересуватися і виконувати необхідні "ремонтні" роботи. Гелеподібна зволожуюча плівка з гіалуронової кислоти дозволяє створювати саме такі умови.

Після застосування косметики з гіалуронової кислотою шкіра виглядає більш м'якою, гладкою і ніжною. І це, не просто зовнішній ефект, справа в тому, що вологе середовище, яке створює гіалуронова кислота у поверхні шкіри, зменшує випаровування води через роговий шар, так як інтенсивність випаровування залежить від відносної вологості навколишнього повітря. Це досить суттєво, оскільки проникність рогового шару для води може різко збільшуватися під впливом УФ-випромінювання, руйнівної дії поверхнево-активних речовин і забруднень, що оточують нас всюди. Гіалуронова кислота у складі сонцезахисних засобів, денних кремів і декоративної косметики може на якийсь час "прикрити" пошкоджений роговий шар, не дозволяючи шкірі зневоднюватися, поки йдуть відновлювальні процеси в епідермісі.       

На відміну від багатьох біологічно активних речовин, гіалуронова кислота проявляє всі свої цінні властивості при дуже низьких концентраціях (0.01-0.1%), що дозволяє створювати ефективну косметику, ціна якої буде влаштовувати як виробників, так і споживачів. В основному, це відноситься до гіалуронової кислоти великої молекулярної маси. В даний час гіалуронова кислота і її солі входять до складу зволожуючих кремів, губної помади і бальзамів для губ, антицелюлітних кремів, гелів для повік, лосьйонів після засмаги, протизапальних лосьйонів, ранозаживляющих і сонцезахисних засобів [31].

В останні роки все ширше практикуються ін'єкції ГК, за допомогою яких в глибокі шари шкіри доставляються великі кількості ГК. Популярний

метод обколювання зморшок і певних зон обличчя дійсно надає шкірі пружність і еластичність, причому ефект досить стійкий і тримається кілька місяців. Вимоги до ін'єкційних препаратів пред'являються більш жорсткі - щоб уникнути побічних алергічних реакцій ГК повинна бути дуже добре очищена від всіляких домішок, особливо білкової природи [29].

В залежності від призначення препарату в ньому краще використовувати комплекси ГК з вельми високою або досить низькою молекулярною масою. Так, в ранозаживляючих і захисних композиціях краще використовувати високомолекулярну ГК, що утворить на поверхні волого утримуючу плівку [31]. ГК з невеликою молекулярною масою підходить для косметичних композицій, у складі яких вона забезпечить не тільки зволожуючий і стимулюючий ефекти [29], але і буде служити переносником для інших активних інгредієнтів [29, 31]. Ефективні кремові композиції, до складу яких входять фракції гіалуронату натрію з молекулярною масою 100-200 кДа [29, 31]. Для запобігання утворення зморшок, підвищення тургору шкіри застосовують фракції ГК з молекулярною масою 50-800 кДа. А для харчування, росту волосся і профілактики облисіння використовують низькомолекулярних ГК з середньою молекулярною масою 1-9 кДа.

У перспективі обсяги застосування ГК в медицині, косметології, харчовій галузі будуть тільки розширюватися. Кожна властивість ГК може знайти застосування в найрізноманітніших сферах людської діяльності.

1.3. Знаходження та біологічні функції ГК у різних організмах

Показано, що ГК в тих чи інших концентраціях зустрічається в складі майже всіх тканин і рідин людини та інших ссавців [23]. У той же час, ГК у представників еволюційно більш давніх організмів, наприклад, найпростіших, губок, кишковопорожнинних, молюсків відсутня. Тим більше дивним здається факт наявності ГК у зеленій водорості, спорідненої до одноклітинної водорості Chlorella і у деяких видів бактерій, наприклад p. Streptococcus [24], р. Pasteurella [25,26].

На перший погляд здається дивним, що прокаріотичні мікроорганізми здатні синтезувати полімер, в точності відповідний полісахаридам хребетних тварин. Але, якщо звернути увагу на екологічну нішу, яку займають представники бактерій, що утворюють ГК, то стає ясно, яке адаптивне і еволюційне значення мало придбання капсули з ГК. Справа в тому, що більшість мікроорганізмів, що утворюють ГК, в тій чи іншій мірі є патогенами вищих тварин, а деякі і людини. Ймовірно, дані мікроорганізми оточили себе масивної капсулою з ГК, за допомогою якої долають клітинну і гуморальний імунну відповідь «хазяїна».

Підводячи підсумок, можна сказати, що ГК є глікозамінгліканом у першу чергу хребетних тварин, проте представленим і в царствах мікроорганізмів і рослин. Скільки ще буде виявлено організмів, що належать до самих різних таксономічних групах і мають здатність до синтезу ГК, можна тільки припускати.

1.3.2. ГК як компонент капсул бактерій

ГК виявляється в капсулах, а при глибинному культивуванні і в культуральній рідині (КР) у деяких бактерій. Наявність в полісахаридній капсулі ГК найбільш характерно для грампозитивних бактерій р. Streptococcus груп А і С [28, 29]. Серед представників бактерій р. Streptococcus, що мають у складі своєї капсули ГК, багато видів, що викликають захворювання людини і тварин.

Грамнегативна паличка р. Multocida хоч і не споріднена бактеріям р. Streptococcus, також містить ГК в капсулі, що оточує клітини мікроорганізмів.

Виходячи з властивостей ГК, можна припустити, що функціями полісахаридної капсули є полегшення міграції клітин бактерій в тканинах ссавців, а також захист клітини бактерії від негативних факторів зовнішнього середовища, наприклад короткочасного висихання і активних форм кисню.

Таким чином, слід підкреслити, що, хоча ГК виникла у бактерій р. Streptococcus як фактор адаптації до імунітету «хазяїна», зараз біополімер виконує і інші різноманітні функції, деякі з яких ще потребують вивчення.

1.4. Шляхи отримання ГК

Вся історія ГК - це історія вдосконалення методів її виділення та очищення. Справа в тому, що якість ГК як фармацевтичного і косметичного інгредієнта визначається її молекулярною вагою. В залежності від джерела і технології одержання ГК її молекулярна вага може варіювати від 70 до 4000 кДа. Чим довше молекулярний ланцюжок і чим менше розкид по молекулярній вазі молекул у зразку, тим краще формується полімерна мережа, тим більше в'язкість розчину при низьких концентраціях і тим більшу поверхню шкіри можна покрити безперервної зволожуючою плівкою.

На сьогодні не знайдено методів хімічного синтезу ГК через її доволі складну молекулярну будову. Основними методами отримання ГК є виділення з тваринної і мікробіологічної сировини.

Найчастіше ГК отримують з півнячих гребенів, але в деяких випадках використовується пуповина людини і склоподібне тіло очей великої рогатої худоби. Етапи виділення включають ГК з тваринної сировини включають такі етапи:

1) ферментативне розщеплення сполучної тканини;

2) специфічне фракціонування з видаленням білків і ліпідів;

3) очищення;

4) первинне екстрагування;

5) осадження та висушування.

Останнім часом ГК все частіше отримують біотехнологічним шляхом з рослинної сировини з використанням бактеріальних культур. Етапи отримання ГК з мікроорганізмів включає в себе наступні етапи:

1) біосинтез: бактерії розмножуються і поміщаються в бродильний чан, де вони синтезують ГК в спеціальних контрольованих умовах;

2) очищення: ГК виділяється з клітин і очищається;

3) осадження та висушування;

4) бактеріологічний і реологічний лабораторний контроль.

Шлях мікробіологічного синтезу дозволяє отримувати великі кількості продукту з заданими молекулярною вагою і стандартизованими реологічними властивостями. Тому він більш вигідний економічно.

1.4.1. Отримання ГК мікробіологічним способом

З моменту відкриття здібності деяких видів бактерій до синтезу ГК безперервно ведуться роботи по дослідженню можливості отримання даного біополімеру біотехнологічним способом, тобто шляхом культивування при заданих умовах штамів-продуцентів на середовищах певного складу з подальшим виділенням цільового продукту. Мікроорганізми, що утворюють капсулу з ГК, вже перераховувалися раніше - це представники р. Streptococcus і р. Pasteurella. Однак лише деяких представників даного роду  можливо використовувати для промислового отримання ГК, оскільки штам-продуцент повинен задовольняти ряду пропонованих критеріїв:

- не бути патогеном людини і не проявляти гемолітичної активності;

- мати досить великі капсули, що містять ГК, причому полісахарид повинен легко відділятися від клітин мікроорганізмів в процесі виділення;

- здійснювати синтез високомолекулярної ГК;

- не мати ферментів, що розщеплюють ГК для запобігання втрат цільового продукту;

- володіти високою питомою швидкістю росту і синтезу ГК, при цьому найбільш повно використовувати субстрат;

- зберігати стабільність бажаних властивостей при тривалому зберіганні культури.

В даний час з відомих продуцентів ГК даним критеріям найбільш повною мірою відповідають стрептококи групи С. Вибір бактеріального штаму для біотехнологічного виробництва ГК досі значною мірою залишається випадковим процесом. Дикі типи стрептококів, як правило, характеризуються синтезом позаклітинних білків, гіалуронатліаз, що істотно знижує вихід цільового продукту. Для отримання гіалуронідазонегативних, не гемолітічних штамів часто застосовують методи хімічного та УФ-індукованого мутагенезу з наступною селекцією за різноманітними схемами. Штами продуцентів, що характеризуються синтезом ГК найбільш високої молекулярної маси, отримують, як правило, також ненаправленим мутагенезом.

Генно-інженерні штами гомологічних або не гомологічних стрептококів бактерій в даний час для виробництва ГК не застосовуються, хоча в деяких наукових дослідженнях клонування та експресія гіалуронатсінтази з бактерій р. Streptococcus або Р. multocida успішно здійснено. Ігнорування генно-інженерних штамів, головним чином, пов'язане з набагато меншим виходом ГК при їх культивуванні.

1.4.2. Механізм біосинтезу ГК

Основні дані по механізму біосинтезу ГК були отримані при вивченні цього процесу у мікроорганізмів головним чином  гемополітичних стрептококів  групи А. Виявилося, що ці дані повністю приложені до процесу біосинтезу ГК і у вищих тварин, як було вперше показано на без клітинних гомогенатах саркоми Роуса.

Було показано, що D-глюкоза є попередником як глюкозаміну, так і глюкуронової кислоти, яка входить до складу ГК. Молекула глюкози утилізується при цьому  повністю, без розриву вуглецевого «скелету».

Далі було встановлено, що безпосередніми попередниками ГК були нуклеотидні похідні (урідіндифосфонуклеотиди) N-ацетилглюкозаміну і глюкуронової кислоти, які відігравали роль донорів вуглецевих залишків у процесі біосинтезу. Ці нуклеотидні похідні були виділені з культур мікроорганізмів, які синтезують ГК, і шляхом ультразвукової дезінтеграції клітин була отримана безклітинна система, яка синтезувала ГК в присутності тільки урідіндифосфонуклеотидів N- ацетилглюкозаміну і глюкуронової кислоти і  іонів Mg2+. Фермент, який здійснював синтез осаджувався і його місце знаходження в інтактній клітині було невідомим. Обробка системи рибонуклеазою і дезокрибонуклеазою не відображалась на синтезі ГК, що відрізняє цей синтез від синтезу білків.