Общая характеристика березового гриба (чаги) и его химического состава

Таблица 2.10 – Хроматографический анализ осадка №5

№ пятна	Система 1				№ пятна	Система 2
	Rf пятна	Видимый свет	УФ	ФМК		Rf пятна	Видимый свет	УФ	ФМК
1	0.79	-	гол	син	1	0.85	-	гол	син

 

 

 

 

 

                      а                                                   б

Рисунок 2.9 – Осадок № 5 в различных системах растворителей:

         а – хроматограмма в системе 1;

                     б – хроматограмма в системе 2.

 

В результате  хроматографического  анализа видим, что осадок № 5 является  индивидуальным  веществом, в УФ - свете флюоресцирует голубым цветом. Предполагаем, что осадок № 5 является фенолокислотой.

Осадок № 5 представляет собой белые кристаллы, с Т_плав=210-212 °С, растворимые  в этаноле (Рисунок 2.10).

 

Рисунок 2.10 – Кристалл осадка № 5

Хроматографический анализ осадка № 5 в выше приведенных системах (№ 4 и 5) также потверждают индивидуальность соединения.

 Пятно в системе 4 имеет Rf=0.93 (Рисунок 2.11,а), в системе 5 имеет Rf=0.30 (Рисунок 2.11,б).

 

 

 

 

 

                    а                                                  б              

Рисунок 2.11 – Хроматограммы осадка № 5 в различных системах растворителей:

       а – Осадок № 5 в системе растворителей 4;

       б – Осадок № 5 в системе растворителей 5.

 

Для проявления хроматограмм использовали следующие качественные

реакции на фенолокислоты [28]:

Реакция азосочетания, приводящая к образованию окрашенных соединений с диазотированным п-нитроанилином: 25 мл 0,3 % раствора п-нитроанилина в 8 % НCl смешиваем непосредственно перед употреблением с 1,5 мл 5 % водного раствора NaNO₂  и полученной смесью обрабатываем хроматограммы. Через несколько минут хроматограмму дополнительно опрыскивают 20 % водным раствором Na₂CO₃.

По литературным данным известно, что п-оксибензойная кислота дает

бледно-желтую окраску, переходящую  в розовую после опрыскивания раствором  карбоната натрия.

Ванилиновая кислота дает желтую окраску, переходящую в фиолетовую, протокатеховая и галловая – желтую окраску, переходящую соответственно в серовато-синию и светло-коричневую, п-кумаровая – желтую

окраску, переходящую в синию.

Осадок № 5 дает желтую окраску, переходящую  в синию. Исходя их этого предполагаем п-кумаровую кислоту.

Образование комплекса  с 1% раствором железоаммониевых  квасцов

FeNH₄(SO₄)₂ ·12H₂O в воде [16].

Фенолы, имеющие орто- диоксигруппы, окрашиваются в зеленый, а три рядовые оксигруппы в синий цвет.

Осадок № 5 с раствором железоаммониевых квасцов не изменяет свою окраску, что  подтверждает наличие лишь одной  фенольной группы.

При вычислении Rf кислот и сравнение с литературными данными было доказано наличие п-кумаровой кислоты (Таблица 2.11).

 

Таблица 2.11 – Хроматографический анализ фенолокислот в различных

                         системах растворителей

№	Кислоты	Rf фенолокислот (литературные данные)		Качественные реакции фенолокислот
		Система 4	Система 5	УФ	ДзПНА	ЖАК
1	п-окибензойная	0.87	0.28	-	роз.	-
2	ванилиновая	0.89	0.40	-	фиолет.	-
3	протокатеховая	0.83	0.05	тем	сер-син	зел.
4	галловая	0.60	0.00	т.ф	св-кор	син.
5	п-кумаровая	0.93	0.30	син	син	-
Результаты исследуемого осадка №5
1	Осадок №5	0.93	0.30	син.	син.		-

 

Таким образом, осадок №5 идентифицирован как фенолокислота - п-кумаровая (Рисунок 2.12).

Данная кислота была выделена как  индивидуальное вещество (Рисунок 2.10). Были определены физико-химические параметры (Т_плав=210-212°С, что соответствует литературным данным п-кумаровой кислоты).

Рисунок 2.12 – п-кумаровая кислота

 

ИК-спектр ν см^-1 (таблетка КВr): 3395 см^-1 (валентные колебания ОН-группы); 2930 см^-1 (углеродный скелет ароматического кольца); 1700 см^-1 (валентные колебания С=О в карбонильной группе); 1650 см^-1 (парадизамещенные в бензойное кольцо); 1450 см^-1 (колебания ОН-группы в кислотах); 1390 см^-1 (колебания ОН-группы в фенолах); 1040 см^-1 (колебания

СН-связи).

Физические характеристики подтверждают предположения о том, что осадок № 5 представлен в виде  п-кумаровой кислоты (Рисунок А.1).

Таким образом, в гексановой фракции выделена и идентифицирована п-кумаровая кислота, содержание, которой от воздушно-сухого сырья составляет 0.02 %. Кроме того, идентифицироаны терпеновые соединения, а именно бетулиновая кислота, бетулин и лупеол.

Исследование  надосадочной жидкости гексанового  экстракта

Полученный гексановый экстракт упариваем, получаем раствор слабо-желтого цвета. Раствор сушим при нормальных условиях, получаем белый осадок с желтым маслообразным вкраплением, которое отмываем петролейным

эфиром. Петролейный  экстракт упариваем, получаем желтую маслообразную

жидкость с массой 0.02г [25].

Хроматографирование полученной маслообразной жидкости в системе растворителей гексан – диэтиловый эфир – ледяная уксусная кислота (73:25:2), характерная для анализа липидов.

На хроматограмме наблюдаем  наличие размытого, характерного для  высших жирных кислот, пятна с Rf от 0.46 до 0.58, с голубым свечением. Из этого можно сделать вывод о наличии высших жирных кислот в маслообразной жидкости из гексанового экстракта.

После того как отделили белый осадок от желтой маслянистой  жидкости, проводим хроматографический анализ осадка. Осадок растворяем в этиловом спирте,  хроматографируем в системе растворителей: хлороформ – бензол – этилацетат (4:8:1). Полученную хроматограмму просматриваем в видимом и УФ-свете, проявляем ФМК.

При хроматографическом анализе осадка выделены пять пятен. Распределение пятен в различных системах растворителей показано в таблице 2.12.

 

Таблица   2.12   –   Хроматографический    анализ    осадка    гексанового

                               экстракта

№ пятна	Rf пятна	Проявитель
		Видимый  свет	УФ	Пары NH3	5% спирт. р-р AlCl3	5% водн. р-р Na2CO3	ФМК
1	0.00	жел	жел	жел	жел	жел	син
2	0.20	св-жел	св-жел	яр. жел	жел	св-жел	син
3	0.40	-	-	-	-	-	син
4	0.57	-	-	-	-	-	син
5	0.73	-	гол	-	гол	гол	син

 

Исходя из полученных данных можно предположить, что в осадке обнаружена фенолокислота, так как  пятое пятно флюоресцирует голубым свечением, а при опрыскивании ФМК проявляется синим цветом. Два пятна можно отнести к терпеновым соединениям. Идентификацию проводили при “свидетелях” – бетулине и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Третье и четвертое пятна оказались идентичны  бетулину (Rf=0.40) и лупеолу (Rf=0.57) соответственно. Второе пятно представлено в виде флавоноида, а именно флавонолы. Для подтверждения проводили качественные реакции на флавоноиды, для этого использовали пары аммиака (NH₃), 5 % водный раствор соды (Na₂CO₃), 5 % спиртовый раствор хлорида алюминия (AlCl₃). При проведении цветных реакций выявили соответствие второго пятна флавонолу, так как реакция на 5 % спиртовый раствор хлорида алюминия дает желтое окрашивание, 5 % водный раствор   соды   давал    светло-желтое   окрашивание, а пары аммиака – ярко-желтое окрашивание. Первое пятно не идентифицировано.

В результате хроматографического  анализа надосадочной жидкости можно сделать вывод о том, что в надосадочной жидкости находятся фенолокислоты, терпеновые соединения (бетулин, лупеол) и флавоноиды (флавонолы).

 

2.3.2 Исследование толуольного экстракта

Экстракцию чаги проводим по схеме  (Рисунок 2.8) в аппарате Сокслета (Рисунок 2.6) при температуре 111°С (Т_кип растворителя). Полученный экстракт упариваем до 10мл. Полученный после экстракции раствор (экстракт) изучаем с помощью ТСХ. Для этого на пластинки “Silufol” наносим анализируемый экстракт. Путем предварительного подбора выявляем наиболее подходящие системы растворителей:

1. хлороформ – бензол – этилацетат(4:8:1);
2. бензол – хлороформ – муравьиная кислота – этанол –  этиловый

эфир (30:5:5:5:10);

Первая система часто  применяется для терпеновых соединений, которая хорошо показала разделение фенолокислот и терпеновых соединений, а вторая

система хорошо разделяет малополярные соединения.

Полученные хроматограммы высушиваем при комнатной температуре, просматриваем их в видимом и УФ-свете, проявляем ФМК, 5 % водным раствором соды, 5 % спиртовым раствором хлорида алюминия, парами аммиака (Таблица 2.13).

Хроматографирование в  первой системе дало наибольшее разделение веществ (6 пятен). В обеих системах наблюдаем флюоресценцию голубым цветом, пятна с Rf₁=0.84 и Rf₂=0.77, которые при опрыскивании ФМК окрашиваются в синий цвет, что предполагает наличие фенолокислот. Пятна 2, 3 и 4 с Rf₁=0.22; Rf₂=0.47; Rf₃=0.63 соответственно, не флюоресцируют в УФ-свете, а с ФМК дают синее окрашивание, что дает основание отнести эти вещества к терпеноидам. Их идентификацию проводили при “свидетелях” – бетулиновой кислоте, бетулине и лупеоле, которые являются основными терпеноидами бересты березы. Пятна 2, 3 и 4 оказались идентичны бетулиновой кислоте (Rf=0.22), бетулину (Rf=0.47) и лупеолу (Rf=0.63) соответственно.

 

Таблица 2.13 - Хроматографический анализ толуольного экстракта

№ пят-на	Rf пят-на	Система 1			Rf пят-на	Система 2
		Вид. свет	УФ	ФМК		Вид. свет	УФ	NH3	5% вод. р-р Na2CO3	5% спирт. р-р AlCl3	ФМК
1	0.00	св. жел	жел	син	0.23	св. жел	тем	жел	жел	св. жел	син
2	0.22	-	-	син	0.30	св. жел	тем	жел	жел	жел-зел	син
3	0.47	-	-	син	0.40	св. жел	гол	-	-	-	-
4	0.63	-	-	син	0.77	-	гол	-	-	-	син
5	0.66	-	гол	-
6	0.84	-	гол	син