Диагностическая эффективность отечественной тест-системы «Лайн-блот cифилис» для диагностики сифилиса методом иммуноблоттинга

Для подтверждения результатов  исследования «сомнительных» образцов, полученных с использованием тест-системы  «Лайн-Блот Сифилис», аналиты, отнесенные в группу «сомнительных», были дополнительно проанализированы в тест-системах «INNO-LIA Syphilis Score» и «ИФА-антипаллидум одностадийная» (ЭКОлаб). Результаты, полученные при исследовании «сомнительных» образцов в тест-системах «Лайн-Блот Сифилис» и «INNO-LIA Syphilis Score», оказались идентичными как по суммарному результату реакции, так и по результатам определения антител к четырем отдельным антигенам, входящим в состав диагностикумов (табл. 4). Совпадение результатов тестирования «сомнительных» образцов, полученных с использованием тест-систем «Лайн-Блот Сифилис» и «ИФА-антипаллидум одностадийная», было получено для 13 из 14 исследованных образцов (93%). Соответствие результатов в тест-системах РИФабс и «Лайн-Блот Сифилис» составило 57% (таблица 5).

Обсуждение  результатов. Разработка технологий производства рекомбинантных антигенов бледной трепонемы способствовала широкому внедрению в серологическую диагностику сифилиса методов иммуноферментного анализа [12, 17-19]. Несмотря на значимость прямых методов обнаружения Т.pallidum, серологические реакции являются в настоящее время основным инструментом диагностики сифилиса. В силу ряда объективных и субъективных причин специфические тесты на сифилис не всегда дают однозначные результаты. В связи с этим достоверность диагноза зависит от количества проведенных исследований, что, в свою очередь, делает всю диагностическую процедуру трудоемкой и дорогостоящей.

В представленной работе диагностическая значимость тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» оценивалась в формате подтверждающего теста. В рамках проведенного исследования тест-система показала высокую (100%)  чувствительность и специфичность по отношению к серопозитивным (n=237) и серонегативным (n=114) образцам, наличие или отсутствие в которых антител против Т.pallidum было подтверждено другими трепонемными тестами.

При исследовании 14 образцов, отнесенных на основании результатов  двух тестов (РПГА и РИФабс) в группу «сомнительных» аналитов, соответствие данных, полученных в тест-системе «Лайн-Блот Cифилис», с данными «INNO-LIA Syphilis score» составило 100% (14/14), с ИФА - 93% (13/14), а с РИФабс - 57% (8/14). Три образца, сыворотки №1/21, №3144 и ликвор №13, охарактеризованные методом РИФабс как «отрицательные», были однозначно «положительными» в тест-системе «Лайн-Блот Cифилис», при этом для образцов №1/21 и №3144 результаты, полученные методом линейного иммуноблоттинга, подтверждались результатами ИФА, что согласуется с данными литературы [10], указывающими на более высокую чувствительность тест–систем, созданных на основе рекомбинантных антигенов, по сравнению с тест-системами, в которых в качестве антигена используются цельные клетки Т.pallidum [20]. В целом, при анализе «сомнительных» аналитов с помощью тест-системы «Лайн-Блот Cифилис», шесть образцов были охарактеризованы как «положительные», один - как «отрицательный», семь – как «сомнительные». Среди семи «сомнительных» образцов в пяти антитела выявлялись только к антигену TpN17, два образца демонстрировали серореактивность, соответственно, только по отношению к антигенам TmpA и TpN15. С одной стороны, выявление у обследуемых лиц антител исключительно к белку TpN17 может отражать факт перенесенного ранее сифилиса [21]. С другой стороны, диагностически значимое антителообразование только по отношению к TpN17 указывает на важность этого антигена для выявления заболевания на самой ранней стадии [22].

Тест-система «Лайн-Блот Сифилис» разрабатывалась в формате  диагностикума, подтверждающего результаты таких высокочувствительных и высокопроизводительных тестов, как ИФА и РПГА. Совокупность антигенных структур, используемых в этих тест-системах, в виде нескольких рекомбинантных белков или всего пула поверхностных белков, выделенных из Т.pallidum, с одной стороны, увеличивает их чувствительность, с другой стороны  - негативно отражается на их специфичности. Дизайн диагностикума «Лайн-Блот Сифилис» основан на принципах, общих для тест-систем подтверждающего формата – на одновременном выявлении серологических маркеров инфекции к отдельным антигенам. Тест-система «Лайн-Блот Сифилис» предназначена для выявления и полуколичественной оценки в ликворе, плазме и сыворотке крови человека уровня IgG-антител против четырех антигенов T. pallidum: TpN15, TpN17, TpN47 и ТmрА. Для сведения к минимуму возможности субъективной ошибки инкубационные растворы, входящие в тест-систему, имеют индикаторную окраску. Практическое применение тест-системы «Лайн-Блот Сифилис» не требует высокой профессиональной подготовки персонала и дорогостоящего оборудования. Кроме того, несложная и непродолжительная (4 часа) процедура анализа в формате тест-системы «Лайн-Блот Сифилис» делают ее удобным инструментом для исследования большого количества образцов в течение одного рабочего дня.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolph A.H. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev 1995; 8: 1–21.

2. Wheeler H.L., Agarwal S., Goh B.T. Dark ground microscopy and treponemal serological tests in the diagnosis of early syphilis. Sex Transm Infect 2004; 80: 411–414.

3. Morse S.A. Advances in diagnostic tests for bacterial STDs. Salud Publica Mex 2003; 45 Suppl 5: 698-708.

4 Rusnak, J.M., Butzin C., MacGlason D. et al. False-positive rapid plasma reagin tests in human immunodeficiency virus infection and relationship to anticardiolipin antibody and serum immunoglobulin levels. J Infect Dis 1994; 169: 1356–1359.

5. Nandwani, R., and Evans D.T.P. Are you sure it’s syphilis? A review of false positive serology. Int J STD AIDS 1995; 6: 241–248.

6. Кубанова А.А., Говорун В.М., Китаева Н.В. и др. Достижения и перспективы изучения Treponema pallidum. Вестн. дерматол. 2006; 5: 34-37.

7. Carlsson B., Hanson H.S., Wasserman J. et al. Evaluation of the fluorescent treponemal antibody-absorption (FTA-ABS) test specificity. Acta Dermatol Venereol 1991; 71: 306–311.

8. Dettori G., Grillo R., Mora G. et al. Evaluation of Western immunoblotting technique in the serological diagnosis of human syphilitic infections. Eur J Epidemiol 1989; 5: 22–30.

9. Byrne R.E., Laska S., Bell M. et al. Evaluation of a Treponema pallidum Western immunoblot assay as a confirmatory test for syphilis. J Clin Microbiol 1992; 30: 115–122.

10. Ebel A., Vanneste L., Cardinaels M. et al.  Validation of the INNO-LIA syphilis kit as a confirmatory assay for Treponema pallidum antibodies. J Clin Microbiol 2000; 38: 215–219.

11. Norris S.J., and the Treponema pallidum Polypeptide Research Group. Polypeptides of Treponema pallidum: progress toward understanding their structural, functional, and immunologic roles. Microbiol Rev 1993; 57: 750–779.

12. Sambri V., Marangoni A., Eyer C. et al. Western Immunoblotting with Five Treponema pallidum Recombinant Antigens for Serologic Diagnosis of Syphilis. Clin Diagnost Lab Immunol 2001; 8: 534-539.

13. Hagedorn H.J., Kraminer-Hagedorn A., De Bosschere K et al. . Evaluation of INNO-LIA syphilis assay as a confirmatory test for syphilis. J Clin Microbiol 2002; 40:973-978.

14. Фриго Н.В., Ротонов С.В., Нестеренко В.Г. и др. Результаты изучения диагностической эффективности новой тест-системы линейного иммуноферментного анализа «Inno- Lia™ Syphilis Score». Клин. лаб. диагн. 2006; 3: 36-41.

15. Кубанова А.А., Фриго Н.В., Ротанов С.В. и др. Иммуноблоттинг в диагностике ранних форм сифилиса. Вестн. дерматол. 2006; 2: 4-11.

16. Фриго Н.В., Ротанов  С.В., Дударева Л.А. и др. Опыт использования метода иммуноблоттинга для диагностики сифилиса. Вестн. дерматол. 2008; 4: 57-62

17. Schmidt B.L., Edjlalipour M., Luger A. Comparative evaluation of nine different enzyme-linked immunosorbent assays for determination of antibodies against Treponema pallidum in patients with primary syphilis. 2000; J Clin Microbiol. 38: 1279-82.

18. Zrein M., Maure I., Boursier F. et al. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbiol 1995; 33: 525-7.

19. Young H., Moyes A., Seagar L. et al. Novel recombinant-antigen enzyme immunoassay for serological diagnosis of syphilis. J Clin Microbiol 1998; 36: 913-7

20. Sordillo E.M., Hoehl B., and Belch J. False-negative fluorescent treponemal tests and confirmation of syphilis infection.1998; J. Infect. Dis. 178:294–295.

21. Кубанова А.А., Нестеренко В.Г., Фриго Н.В. и др. Опыт использования метода иммуноблоттинга для диагностики сифилиса. Вестн. дерматол. 2006; 2: 4-11.

22. Дударева Л.А. Клиническая  оценка современных методов диагностики  у больных ранними формами сифилиса. Автореферат дисс. ... канд. мед. наук. М; 2007

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис 1 . Схема нанесения антигенов T.pallidum, контролей и калибраторов на нитроцеллюлозном стрипе в тест-системе «Лайн-Блот Сифилис»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 2. Результаты исследования сывороток крови из наборов контрольных материалов «П-АТ-Т.pallidum», содержащих (№1 - 16) и несодержащих (№17 - 24) антитела к Т.pallidum. Нумерация стрипов соответствует нумерации образцов, входящих в набор «П-АТ-Т.pallidum»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                                                          Таблица 1.

Оценка иммунореактивности контрольных сывороток №1 – 16 набора

«П-АТ-Т.pallidum», выраженная в баллах, по отношению к четырем рекомбинантным антигенам (TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA)

 

Антиген	№ образца
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
TpN15	0	0,5	0	1	1	2	3	1	0,5	1	1	0,5	1	2	0,5	0,5
TpN17	2	3	2	4	3	4	4	2	2	4	2	3	2	4	3	3
TmpA	0,5	0,5	0,5	1	0,5	2	3	1	0	1	0,5	1	1	2	0	0
TpN47	1	0	0	2	2	2	3	3	2	2	2	1	2	3	1	1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 2.

Результаты сравнения  данных, полученных при исследовании сывороток крови в тест-системе «Лайн-Блот Сифилис» и других трепонемных тестах (РПГА, РИФабс/РИБТ)

 

Результат РПГА, РИФабс/РИБТ	Результат «Лайн-Блот Сифилис»
	отрицательные	положительные	сомнительные	общее кол-во
отрицательные#	57#	0	0	57#
положительные	0	156	0	156
сомнительные	1	2	3	6
общее кол-во	58	158	3	219

Примечание: # - сыворотки донорской крови (n=57), негативные по наличию серологических маркеров сифилитической инфекции в трех тестах (RPR, РПГА и ИФА).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 3.

Результаты сравнения  данных, полученных при исследовании образцов ликвора в тест-системе «Лайн-Блот Сифилис», и других трепонемных тестах (РПГА, РИФабс/РИБТ)

 

Результат РПГА, РИФабс/РИБТ	Результат «Лайн-Блот Сифилис»
	отрицательные	положительные	сомнительные	общее кол-во
отрицательные	23	0	0	0
положительные	0	17	0	17
сомнительные	0	4	4	8
общее кол-во	23	21	4	48

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 4.

Результаты оценки иммунореактивности «сомнительных» образцов в тест-системах «Лайн-Блот Сифилис» и «INNO-LIA Syphilis Score» по суммарному результату реакций и по отношению к каждому из четырех рекомбинантных антигенов

 

№ образца		«Лайн-Блот Сифилис»					«INNO-LIA Syphilis score»
		TpN15	TpN17	TmpA	TpN47	Рез.	TpN15	TpN17	TmpA	TpN47	Рез.
сыворотка	23/13657	0	1	0	0	±	0	2	0	0	±
	1/21	0,5	0,5	0	0,5	+	2	0,5	0	1	+
	3519	0	0,5	0	0	-	0	0,5	0	0	-
	5202	1	0	0	0	±	1	0	0	0	±
	3144	0,5	0,5	0	1	+	1	2	0	1	+
	4/108	0	1	0	0	±	0	2	0	0	±
ликвор	3	0	1	0	0	±	0	3	0	0	±
	4	0	0	1	0	±	0	0	1	0	±
	13	0	1	0,5	0	+	0	2	0,5	0	+
	15	0	1	0	0	±	0	2	0	0	±
	16	0	1	0	0	±	0	1	0	0	±
	17	0	0,5	1	0,5	+	0	1	1	0,5	+
	10/3424	0,5	1	0,5	0	+	0,5	2	0,5	0	+
	9/3422	0	1	0,5	0	+	0	2	0,5	0	+