Правила работы в вирусологической лаборатории

В каждом случае заболевания с подозрением на вирусную этиологию в первую очередь надо выделить возбудителя из патматериала. В этой связи правильный отбор и обработка материала имеют очень большое значение для успешного обнаружения вируса.

Материал для исследования. От заболевших, павших или вынужденно убитых животных его отбирают как можно быстрее после Появления четких признаков болезни или не позднее 2...3 ч после их клинической смерти или убоя. Это связано с тем, что сразу после заболевания или в первые 1-2 дня болезни значительно ослабевает барьерная роль кишечника, что наряду с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов, способствует дессими-нации кишечной флоры. Кроме того, по мере продолжения инфекционного процесса количество вируса может уменьшаться в результате воздействия защитных механизмов организма.

I I

При взятии материала для выделения вируса следует исходить из патогенеза изучаемой инфекции (входные ворота, пути распространения в организме, места репродукции и пути выделения). Так, при респираторных инфекциях для выделения вирусов берут носоглоточные смывы, мазки из носовой полости и глотки, соскобы трахеи и кусочки легкого трупов; при энтеровирусных — кал; при нейротропных — кусочки головного или спинного мозга; при дерматропных инфекциях — свежие поражения кожи и т.п., т.е. отбирают тот материал, в котором предполагается наибольшая концентрация вируса. Материалом для выделения вируса могут служить различные экскреты и секреты, кусочки органов, кровь, лимфа и пр. (рис.2).

При вскрытии трупов животных материал отбирают при строгом соблюдении всех правил асептики и антисептики, чтобы не заразиться самому, не внести посторонних возбудителей в исследуемый материал и не допустить распространения инфекционного начала.

Кровь берут из яремной вены, у свиней — из кончика хвоста или уха. Лучше кровь у свиней брать из венозного сплетения глаз. При этом пользуются шприцем "Рекорд" (на 20 мл) и иглой №12-30, которую вводят по внутреннему углу костной орбиты (скос иглы направлен в сторону костной орбиты) к противоположному уху до упора, затем оттягивают на 1-1,5 см, и набирают кровь.

Для выделения вируса используют цельную дефибриниро-ванную, "лаковую" кровь (смесь крови с дистиллированной водой в отношении 1:1), либо отдельные элементы крови (эритроциты, лейкоциты, плазма, сыворотка). Для обнаружения противовирусных антител кровь берут у одного и того же животного дважды с интервалом в 2...3 недели (для получения парных сывороток в объеме не менее 5,0 мл каждой).

Смывы со слизистой оболочки носовой полости, глаз, с задней стенки глотки, прямой кишки и клоаки у птиц берут стерильными ватными тампонами и погружают их в пенициллиновые флаконы или пробирки, содержащие 3-5 мл соответствующей жидкости. Наиболее часто для этого используют раствор Хенкса или среды для культур клеток (ГЛА, 199, Игла) с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин по 500 ЕД и нистатин по 20 ЕД на 1мл среды) с белковым стабилизатором, например, 0,5%-ным раствором желатина или 0,5...1%-ным раствором альбумина бычьей сыворотки. Присутствие стабилизаторов необходимо для предотвращения быстрой инактивации некоторых вирусов, например, вируса парагриппа.

При взятии материала из носоглотки можно использовать прибор, сконструированный Томасом и Стоком. Он состоит из трубки диаметром 9 мм и длиной 30 см, внутри которой помещается вторая тонкая  трубка   с   нержавеющим   стержнем,    оканчивающимся нейлоновой щеткой. Прибор вводят глубоко в носовые ходы (хоа-ны) или в горло через носовой ход, выдвигая щеточку, а затем вновь задвигая ее в трубку перед тем, как вынуть прибор из органа. Щеточку тщательно отмывают от слизи и клеток в 2 мл жидкости (раствор Хенкса).

Слюну отбирают при наличии признаков поражения ротовой полости или слюнных желез. Вытекающую изо рта слюну можно собрать прямо в пробирку. Если ее выделяется мало или она не вытекает, необходимо пропитать слюной стерильный тампон на палочке, а затем поместить в пробирку с небольшим количеством раствора Хенкса и закрыть резиновою пробкой. Для усиления слюноотделения животному можно ввести пилокарпин из расчета 0,02...0,05 г на 1 кг маосы.. м~<^     ^f**^*f*f

Мочу отбирают при помощи катетера в стерильную посуду. Фекалии берут из прямой кишки при помощи шпателя или палочкой и помещают в стерильную пробирку или пенициллино-вый флакон.

Везикулярную жидкость собирают шприцем или пастеровской пипеткой в стерильную пробирку.

Стенки афт, корочки с поверхности кожи снимают пинце-

том.

Спинномозговую жидкость используют редко. Ее берут асептически путем обычной пункции.

В качестве патматериала используют кусочки органов объемом несколько см³ и массой 10-20 г, которые:

а) имеют видимые отклонения от нормы по форме, размеру, цвету, консистенции, наличию необычных образований;

б) могут быть поражены и содержать вирус;

в) наиболее часто содержат вирус — печень, селезенка, легкие, головной мозг, лимфатические узлы, почки. *

Транспортировка и хранение проб. Взятие пробы рекомендуется как можно быстрее поместить в условия, обеспечивающие замедление процессов инактивации вируса. Такие условия обеспечивают низкие температуры. Для этого пробирки (флакончики) с патмарериалом,      закрытые      резиновыми пробками, помещают в термос с охлаждающей  смесью.  На рис.3  дано  изображение элементов  упаковки  вирусных  проб.  Первичная емкость: 1 — емкость, содержащая пробу (пробирка с завинчивающейся пробкой с нетоксичной резиновой прокладкой, обернутой лейкопластырем, или запаянная стеклянная ампула); внутренняя упаковка: 2 — поглощающий материал — папиросная Рис.3. Элементы      бумага или вата в количестве, достаточном упаковки вирусных    д_ЛЯ впитывания жидкости в случае утечки; проб

3 — пластиковый мешок, заполненный или заклеенный неволокнистым лейкопластырем; наружная упаковка: 4 — противоударная прокладка, (скомканная бумага или вата); 5 — твердый водонепроницаемый контейнер; 6 — плотно пригнанная крышка, завинчиваемая или уплотняемая, заклеиваемая лейкопластырем или закрепляемая специальными зажинами В качестве охлаждающей смеси используют смесь равных частей сухого льда (твердая углекислота) и этилового спирта, тогда температура -71 °С держится несколько дней. Можно использовать смесь, состоящую из трех весовых частей льда или снега и одной весовой части поваренной соли. В последнем случае удается получить температуру -(15...20) °С. Вместо замораживания можно использовать химические консерванты, но это менее эффективно. Лучшим из них считается смесь равных объемов стерильного глицерина и 0,85%-ного раствора поваренной соли (изотонический раствор). Обычно эту смесь рекомендуют использовать для консервирования кусочков паренхиматозных органов и тканей.

Глицерин — это простейший трехатомный спирт. Он смешивается с большинством компонентов живой клетки. В него быстро диффундирует вода и электролиты, а сам он легко проникает в другие растворы и гели и не переходит в твердое состояние при низких температурах (-110 °С).

Растворы глицерина менее пригодны для вируссодержащих жидкостей, особенно в тех случаях, когда этот материал нужно вводить животным, эмбрионам и в культуру клеток в неразведен-ном виде. Употребление его делает невозможным исследование патологического материала методом иммунофлуоресценции, поэтому одновременно с пробой патматериала необходимо направить

мазки-отпечатки, приготовленные и фиксированные на предметном стекле, для исследования на люминесцентном микроскопе.

Патматериал снабжают надежной и четкой этикеткой (рис.4.) недопустимо делать надписи карандашом по стеклу. На пробирке или флакончике достаточно надежной является этикетка из лейкопластыря, которую подписывают простым карандашом. На термос с пробами патматериала навешивают бирку из

Рис.4. Предупреждающая этикетка, картона или фанеры, на ко-предложенная ВОЗ, для обозначения _торою указывают хозяйство, инфекционных субстанций, включая   _{ввд животного> вид мате}р_Иала

и дату. Термос опечатывают. Взятый материал с сопроводительным документом, содержащим полную информацию о животном, от которого взяты пробы, об эпизоотологических данных хозяйства, предположительном диагнозе и мерах, принятых для ликвидации болезни (лечение, вакцинации и т.д.), а также дату и фамилию ветеринарного врача, направляют с нарочным. Этими данными руководствуются при выборе направления лабораторных исследований. Доставленные в лаборатории пробы рекомендуется немедленно использовать для выделения вируса. Если по каким-то причинам (отсутствие экспериментальных животных, куриных эмбрионов, культур клеток) исследование откладывается, материал хранят при температуре -(40...70) °С. большинство вирусов в крови, спинномозговой жидкости, моче, соскобах и смывах носоглотки быстро разрушается, а вирус парагриппа кр. рог. скота и респираторно-синцитиальный вирус быстро погибают при замораживании, поэтому успех их выделения зависит от быстроты исследования. Если нет уверенности в том, что исследуемое инфекционное заболевание было вызвано только вирусом, часть материала следует отдать для бактериологического и микологического исследований.

Подготовка вируссодержащего материала. В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают или измеряют. Часть берут для вирусологического анализа, оставшуюся — хранят в холодильнике на случай необходимости дополнительных исследований. Затем составляют план исследований присланного материала.

Подготовку вируссодержещего материала для заражения чувствительных объектов осуществляют двумя методами: с помощью обработки антибиотиками или путем стерилизующего фильтрования.

Подготовка органов и тканей. Вирус необходимо высвободить из клеток органов и тканей и перевести в раствор Хенкса. для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Добавлять толченое стекло менее желательно, так как оно обладает щелочными свойствами и может инактивировать часть вирусных частиц. Но и на тонко растертых песчинках или частицах стекла, обладающих большой поверхностью, часть вируса может адсорбироваться и уйти затем в удаляемый осадок. Из растертого материала обычно готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса. Полученную суспензию на растворе Хенкса центрифугируют при 1500...3000 об/мин в течение 15...30 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры, либо пропуская через бактериальные фильтры (это делают редко, так как теряется много вируса за счет адсорбции на фильтре), либо обрабатывают антибиотиками широкого спектра действия  (пенициллин,  стрептомицин,  нистатин,  тетрациклин, кристалломицин и т.д.). Дозы антибиотиков, применяемых для этой цели, могут колебаться в довольно широких пределах (от 100 до 1...2 тыс. ЕД и более на 1 мл) в зависимости от характера исследуемого материала. Рекомендуют следующие дозы антибиотиков: пенициллина 1000 ЕД, тетрациклина 100 мкг, стрептомицина 500 ЕД, нистатина 30 ЕД на 1 мл. Следует избегать излишне больших доз, так как их избыток при дальнейшем внесении в культуру клеток может вызвать неспецифическую дегенерацию последних. Предпочтительность тех или иных доз антибиотиков и оптимальный режим центрифугирования в каждом конкретном случае указан в инструкции по диагностике соответствующих вирусных болезней.

Экспозиция суспензии с антибиотиками должна быть не менее 30...60 мин при комнатной температуре, затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при -(20...70) °С.

Подготовка выделений из носа и глаз. Тампоны погруженные в соответствующий раствор, встряхивают 10... 15 мин, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют 20 мин при 2000...3000 об/мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрептомицин по 500... 1000 ЕД на 1 мл, выдерживают и после бактериологического контроля используют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ.

Подготовка фекалий. Пробу кала (приблизительно около 1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса. После гомогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугирования при 2000...3000 об/мин в течение 30 мин надосадочную жидкость отсасывают, добавляют пенициллин, стрептомицин по 500... 1000 ЕД/мл, нистатин 30 ЕД/мл и тетрациклина 200 мкг/мл. После 30...60 мин контакта производят посев на стерильность, замораживают и хранят при -(10...20) °С. В день заражения животных или культуры клеток исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образующегося поле замораживания осадка. Неиспользованный материал хранят в замороженном состоянии до конца исследований. Исследование кала может быть заменено ректальными мазками, обработка которых требует меньше времени, а частота выделения вируса при этом не только не меньше, но иногда выше.

Мочу обрабатывают антибиотиками 500...1000 ЕД/мл и используют для заражения.

При кожных высыпаниях исследуют содержимое папул, пузырьков и пустул, чешуйки и корки. Содержимое папул и пузырьков разводят раствором Хенкса в соотношении 1:5, а корки, чешуйки после растирания суспендируют в солевом растворе 1:5-1:10 и подвергают центрифугированию при 2000...3000 об/мин в течение 10...15 мин. После обработки пенициллином и стрептомицином (по 200...500 ЕД/мл) материал используют для заражения.

Подготовка крови. Для выделения вируса может быть использована цельная дефибринированная, "лаковая" кровь или кровь с антиксагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку с 5-6 каплями гепарина и замораживают. После оттаивания гемолизированную кровь 15 мин центрифугируют при 2000...3000 об/мин в течение, добавляют пенициллин и стрептомицин из расчета 100...200 ЕД/мл и после проверки на стерильность используют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и добавляют небольшое количество раствора Хенкса (1:1 или 1:2), а далее поступают аналогично.

Для освобождения вируссодержащего материала от микроорганизмов применяют стерилизующее фильтрование. Чаще всего используют асбестовые пластинки, керамические свечи, колло-дийные мембраны и стеклянные фильтры. Асбестовые фильтры готовят из прессованного асбеста в виде кружков диаметром 35, 140 и 350 мм. Выпускают фильтры марки "Ф" (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие частично бактерии, и "СФ" (стерилизующие), задерживающие все* виды бактерий, не пропускающие вирусы.

Коллодийные мембраны (ультрафильтры) готовят из нитроклетчатки (коллодия) с точно калиброванными порами. Иногда их называют градоколовыми фильтрами (англ. graduate — калибровать; кол — от слова коллодий). Широкое распространение получили мембранные фильтры. Для фильтрования вирусов используют фильтры с диаметром пор 100-400 нм. В настоящее время мембранные фильтры являются наиболее совершенными.