Правила работы в вирусологической лаборатории

2. Просмотреть под микроскопом демонстрационные и самостоятельно приготовленные препараты.

3. Зарисовать в рабочую тетрадь вирионы и внутриклеточные включения Бабеша-Негри.

Примерный план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснение преподавателя.

3. Самостоятельная работа студентов: а) приготовление препаратов-отпечатков и окраска их по Морозову; б) нахождение в приготовленных препаратах вирионов оспы и их схематическая зарисовка.

4. Подведение итогов занятия.

5. Задание к следующему занятию.

Методические указания Вначале дается характеристика методов лабораторной диагностики вирусных инфекций, а затем более подробно рассматривают вирусоскопический метод исследования с использованием светового микроскопа. Препаратами с тельцами-включениями могут служить гистологические срезы головного мозга животных, содержащие тельца Бабеша-Негри (окраска по любому методу).

Такие препараты можно получить в вирусологических отделах ветеринарных лабораторий.

Мазки для выявления вирусов оспы готовят непосредственно на занятиях из вирус-вакцин и окрашивают по Морозову. Вопросы домашнего задания

1. Классификация вирусов.

2. Люминесцентная микроскопия и ее сущность.

3. Устройство люминесцентного микроскопа МЛ-2 и правила работы с ним.

4. Использование метода флуорохромирования в вирусологической практике.

ЗАНЯТИЕ 4. Люминесцентная микроскопия. Метод флуорохромирования

Цель занятия: ознакомиться с устройством люминесцентного микроскопа, правилами работы с ним и методикой флуорохромирования, используемой в вирусологической практике.

Оборудование и материалы: люминесцентный микроскоп любой марки, набор флуорохромов для люминесцентной микроскопии, нефлуоресцирующее иммерсионное масло, предметные и покровные стекла, фиксажницы с фиксатором (любым, применяемым в вирусологической практике), оспенный детрит или культура клеток, зараженная вирусом осповакцины или вакцинными штаммами вирусов других видов, дистиллированная вода, флаконы из темного стекла, весы ручные, разновесы, таблицы по теме, диапозитивы.

Краткие теоретические сведения

\/Люминесцентная микроскопия — один из высокочувствительных и весьма перспективных современных методов исследования. Он позволяет обнаруживать даже небольшие концентрации вирусов в исследуемом материале. В люминесцентном микроскопе видны многие микроструктуры, неразличимые в обычном световом микроокопе, благодаря их природной флуоресценции или обработке особыми красителями — флуорохромами. Это такие вещества, которые обладают интенсивной флуоресценцией. Они широко используются в люминесцентной микроскопии для обработки биологических объектов, имеющих слабую собственную флуоресценцию.

Люминесценция (флуоресценция) — это свечение веществ под воздействием различных видов энергии, возникающее в результате преобразования энергии, поглощенной данным веществом. Молекулы, поглощающие кванты внешней энергии, приходят в возбужденное состояние, вследствие чего их электроны переходят на орбиты более высоких энергетических уровней. При возвращении на прежние орбиты они отдают избыток энергии в виде квантов света — фотонов. Непрерывный поток фотонов, из

Рис 13. Общий вид люминесцентного микроскопа МЛ-2 (о) и люминесцентные лампы (б): СВДШ-250-3 (слева) и СВД-120 (справа): 1 — кварцевая колба; 2 — токоведущие электроды; 3 — электрод поджига; 4, 5 — цоколи ламп; 6 — отрезки молибденовой фольги,

впаянные в кварц

лучаемых возбужденным веществом, и есть люминесценция. Люминесцентное свечение подчиняется правилу Стокса, согласно которому свет флуоресценции имеет большую длину волны, чем свет возбуждения, примерно на 50...120 нм. Это позволяет отфильтровывать сравнительно слабую флуоресценцию от более ярких возбуждающих лучей. В современных люминесцентных микроскопах используют чаще всего сине-фиолетовые лучи, получаемые с помощью специальных фильтров. После возбуждения люминесценции они поглощаются желтым светофильтром, который укрепляется на окуляре. В результате создается темный фон в поле зрения микроскопа.

В настоящее время в лабораториях используют люминесцентные микроскопы МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3, МЛ-4 и микроскопы серии "Люмам". В любом из них можно выделить три основные части: собственно микроскоп, осветительное устройство и источник света (рис.13). Осветительное устройство состоит из кварцевого коллектора, полевой и апертурной диафрагм, регулирующих поток света и камеры со светофильтрами, последние применят для выделения из светового потока сине-фиолетовых лучей. Вирусологические препараты изучают в Падающих сине-фиолетовых лучах. Они проходят через окуляр и падают на препарат. Для их выделения используют следующие светофильтры: БС-8 (бесцветное стекло, задерживающее ультрафиолетовые лучи), СЗС-7 или СЗС-14 (сине-зеленое стекло, пропускающее синие лучи), ФС-1 (фиолетовое стекло, пропускающее фиолетовые лучи) и ЖС-18 (запирающий светофильтр, отсекающий лучи возбуждения и пропускающий лучи, исходящие из препарата).

Источником света в люминесцентных микроскопах служат ртутно-кварцевые лампы,  обладающие большой поверхностной яркостью. На пути светового потока помещают кювету с дистиллированной водой для защиты препарата от тепловых (инфракрасных) лучей. Но в некоторых случаях применяют и проходящее через зеркало микроскопа освещение объектов. Кроме того, предусмотрена возможность темнопольного освещения объекта и фотографирования.

Микроскоп устанавливают в затемненной части комнаты на прочном столе. Следует исключить вибрацию, которая создает помехи при микрофотографировании. В помещении должна быть хорошая вентиляция, устраняющая вредные газы от источника света.

Подготовка микроскопа к работе сводится к следующему. При закрытой шторке кварцевого коллектора и положении рычага пульта управления острием к точке (красной или черной) нажатием кнопки пускового дросселя зажигают лампу. Лампа достигает полной силы света через 5... 10 мин после включения при силе тока 4...5 А. Повторное включение лампы возможно только после ее охлаждения. Чтобы привести микроскоп в рабочее состояние, рукой выдвигают до отказа правую рукоятку светодели-тельного зеркала и переключатель светоделительной пластинки с кольцевым зеркалом. Револьверный диск со светофильтрами устанавливают в положении 1 или 2. На столике микроскопа устанавливают препарат, закрепляя его зажимами препаратоводителя. На препарат наносят каплю нефлуоресцирующего иммерсионного масла или его заменителей (диметилфталат и др.). Под контролем глаза макровинтом осторожно опускают тубус до соприкосновения объектива с иммерсионным маслом. При этом препарат вспыхивает сине-фиолетовым цветом. Затем отыскивают изображение, устанавливая резкость микровинтом.

После окончания работы, поднимают тубус, салфеткой вытирают масло с объектива, револьвер переводят на малое увеличение, отключают лампу, накрывают микроскоп чехлом.

По мере износа ртутно-кварцевой лам.пы или при необходимости лучшего свечения препаратов следует употреблять менее плотные фильтры названных спецификаций, имеющиеся в наборе. Фильтры должны быть чистые, хорошо протертые. Дистиллированную воду в кювете надо менять два раза в месяц. При каждой смене воды кювету следует промыть. Стекла кюветы должны быть прозрачными, помутневшие заменяют.

В вирусологической практике люминесцентную микроскопию используют в двух основных методах: флуорохромировании и методе флуоресцирующих антител.

Фщщ>~ОЩ}омированм£-— ^это обработка препарата одним или несколькими флуорохромами с целью увеличения силы и контрастности свечения. Метод флуорохромирования может быть использован для: 1) обнаружения крупных вирусов; 2) выявления внутриклеточных включений; 3) излучения ЦПД вируса в культуре клеток; 4) определения типа нуклеиновой кислоты вируса.

Предложено большое количество соединений для флуорохромирования биологических объектов. Наиболее широко применяется акридиновая группа (акридин оранжевый, акридин желтый) и тиазоловая (примулин) группа. Флуорохромы чаще всего црименяют в водных растворах (дистиллированная вода, физиологический раствор) в очень слабых концентрациях, от 1:100 до 1:1 млн. Можно прибавлять к растворам до 3% фенола. Оптимальную концентрацию флуорохрома подбирают индивидуально.

Промышленность в настоящее время выпускает специальные наборы флуорохромов. Они сохраняются в течение многих месяцев без изменения при хранении их в темных флаконах и прохладном месте.

Наибольший интерес представляет акридин оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеино-пых кислот. При этом ДНК ярко флуоресцирует желто-зеленым цветом, а РНК — рубиново-красным. Для его приготовления в смеси физиологического раствора и фосфатного буфера (рН 7,2...7,4) в соотношении 7:3 делают слабый раствор флуорохрома (1:10000-1:20000). Фосфатный буфер состоит из двух растворов: 1) 1/15 М раствор двузамещеннного фосфата натрия Na2HP0₄ • 2Н2О (1,187 г на 100 мл дистиллированной воды) или 1/15 М раствор Na₂HP0₄ (0,947 г на 100 мл дистиллированной воды); 2) 1/15 М раствор однозамещенного фосфата калия КН2РО4 (0,908 г на 100 мл дистиллированной воды). Для получения рН 7,2 растворы 1 и 2 смешивают в соотношении 7,2:2,8. Затем готовят маточный раствор акридина оранжевого 1:1000 (0,01 г его растворяют в 10 мл смеси, состоящей из 7 мл физраствора и 3 мл фосфатного буфера с рН 7,2). На холоде этот раствор может храниться в пределах трех месяцев. Чтобы из маточного раствора приготовить рабочий — 1:10000, к 1 мл его добавляют 9 мл растворителя (физраствор на фосфатном буфере).

Препараты для метода флуорохромирования готовят двумя способами: 1) На свежий препарат-отпечаток из органов, соскобов со слизистых оболочек или суспензии инфицированных клеток наносят 1-2 капли рабочего раствора акридина оранжевого 1:10000, накрывают покровным стеклом. Приготовленный таким образом свежий (в течение 10...20 мин после приготовления) препарат рассматривают в люминесцентном микроскопе; 2) препараты-отпечатки, полученные из патологического материала или инфицированные культуры клеток на покровных стеклах фиксируют 96° этиловым спиртом в течение 15...30 мин, промывают раствором Хенкса, наносят на препарат 1-2 капли раствора акридина оранжевого (1:10000), через 5...10 мин раствор флуорохрома сливают, препарат промывают и исследуют под микроокопом.

В результате окрашивания ДНК, содержащаяся в ядрах клеток, дает изумрудно-зеленое свечение, а РНК, находящаяся в цитоплазме, светится красным или оранжевым цветем. В препаратах ДНК-содержащихся вирусов, например, аденовируса, вирусный материал в ядре клеток в виде гранул различной величины светится зеленым цветом. При наличии в препарате РНК-содержащего вируса, например, вируса гриппа, вирусный материал обнаруживается в виде ярко-красных гранул в цитоплазме клеток (рис.14).

Рис.14. Многоядерный синцитий в клетках линии РК15, зараженных

вирусом миксомы, при увеличении х420 (слева) и х480 (справа). Окраска акридином оранжевым

Чтобы различить происхождение ДНК или РНК (клеточная или вирусная) применяют обработку препаратов 0,5% -ным раствором ДНК-азы или РНК-азы в течение 5...10 мин или облучение ультрафиолетовыми лучами. При этом свечение клеточных РНК или ДНК сразу исчезает, а вирусные нуклеиновые кислоты продолжают светиться еще 20...30 мин. Это служит доказательством специфичности вирусных нуклеиновых кислот.

Метод флуорохромирования не сложен, но он не дает возможности идентифицировать возбудителей заболеваний.

В ходе самостоятельной работы студентов необходимо *

1. Ознакомиться о устройством люминесцентного микроскопа, техникой включения и подготовкой к работе.

2. Ознакомиться о основными видами флуорохромов.

3. Приготовить раствор акридина оранжевого 1:10000, рН 3,8.

4. Приготовить препараты из различного вируссодержащего материала.

5. Обработать препараты раствором флуорохрома.

6. Просмотреть препараты под микроскопом и зарисовать в рабочую тетрадь.

Примерней план занятия (2 ч)

1. Контрольный опрос.

2. Объяснения преподавателя.

3. Самостоятельная работа студентов: а) демонстрация физиологического раствора; б) фосфатного буфера; в) набора флуорохромов; г) препаратов для вирусоскопии.

4. Подведение итогов занятия.

5. Задание к следующему занятию.

Методические указания

При проведении занятия в качестве материала для приготовления препаратов можно использовать любой, полученный от животных, куриных эмбрионов или культур клеток, инфицированных вирусом, с которыми работают сотрудники кафедры.

Ввиду дефицита учебного времени демонстрацию и некоторые объяснения преподавателя можно совмещать с окрашиванием препаратов.

Вопросы домашнего задания

1. Репродукция вирусов.

2. Метод иммунофлуоресценции и его варианты.

ЗАНЯТИЕ 5. Люминесцентная микроскопия. Метод иммунофлуоресценции

Цель занятия: ознакомиться с различными вариантами метода иммунофлуоресценции, применяемыми в вирусологической практике.

Материалы и оборудование: препараты-отпечатки с любым вирусным антигеном (на двух студентов — один препарат), соответствующие антивирусные флуоресцирующие сыворотки, флуоресцирующие сыворотки против глобулинов кролика, комплемент морской свинки, дистиллированная вода, физиологический раствор, пробирки с резиновыми пробками, пастеровские пипетки, пипетки на 1 и 5 мл, влажная камера, фильтровальная и черная бумага, предметные и покровные стекла, забуференный глицерин, нефлуоресцирующее иммерсионное масло, люминесцентный микроскоп, таблицы по теме, диапозитивы.

Краткие теоретические сведения

Метод иммунофлуоресценции впервые был предложен Альбертом Кунсом в 1942 году. Данный метод для ранней диагностики инфекционных заболеваний животных в ветеринарии начал изучать П.И.Притулин в 1955 году.

Принцип данного метода заключается в том, что антитела, предварительно соединенные с флуорохромами, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген-антитело обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению благодаря присутствию в нем флуорохрома. В качестве красителя антител наиболее часто применяют ФИТЦ — флуоресцеина изо-тиоцианат (зеленое свечение) и PCX — родамина сульфохлорид (красное свечение).